唐繼貴++++++魏品康++++++張映城

[摘要] 目的 研究新生血管在胃病發(fā)展不同時(shí)期胃黏膜中的生成情況及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）-A/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）-2的調(diào)控作用。 方法 選擇2012年1～12月上海長(zhǎng)征醫(yī)院胃鏡室收集非癌變胃黏膜組織（包括慢性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、腸腺化生）及病理科收集胃癌組織（包括癌組織、癌旁近端、癌旁遠(yuǎn)端）各20例。采用免疫組化SP法檢測(cè)微血管密度（MVD）；Western Blot及RT-PCR法檢測(cè)VEGF-A/VEGFR-2的表達(dá)。 結(jié)果 新生血管在慢性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、胃黏膜腸腺化生、胃癌不同區(qū)域的表達(dá)存在差異，其中，在胃炎胃黏膜中新生血管相對(duì)稀疏，而胃息肉、胃潰瘍和胃黏膜腸腺化生新生血管稍密集，胃癌新生血管明顯密集，有形成血管腔形狀?？傮w上，MVD隨著組織惡性轉(zhuǎn)化傾向存在遞增趨勢(shì)，胃炎低于胃息肉、胃潰瘍、胃黏膜腸腺化生、癌旁遠(yuǎn)端，低于癌旁近端，低于胃癌（P < 0.05）。VEGF-A/VEGFR-2對(duì)新生血管存在明顯的調(diào)控作用，其表達(dá)和MVD變化高度一致。 結(jié)論 微血管生成貫穿在胃黏膜病變不同時(shí)期，VEGF-A/VEGFR-2信號(hào)通路對(duì)新生血管具有調(diào)控作用，抑制微血管生成可能具有阻斷胃黏膜惡性病變的意義。

[關(guān)鍵詞] 胃黏膜癌變；新生血管；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）12（a）-0011-04

大量研究表明，新生血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有重要作用[1]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路是調(diào)控新生血管的關(guān)鍵信號(hào)通路，其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）-A和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）-2被認(rèn)為和腫瘤微血管生成密切相關(guān)[2]。研究證實(shí)，在結(jié)腸癌[3]、乳腺癌[4]、胃癌[5]等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)微血管密度（microvascular density，MVD）平均值隨著TNM分期逐步增高。李學(xué)成等[6]、田小林等[7]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中VEGF-A陽(yáng)性率明顯高于正常組織。但胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能經(jīng)歷的不同階段胃黏膜微血管生成情況及與VEGF-A/VEGFR-2的關(guān)系少見(jiàn)報(bào)道。為此本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)MVD，Western Blot及RT-PCR法檢測(cè)VEGF-A/VEGFR-2的表達(dá)，研究VEGF-A/VEGFR-2信號(hào)通路與新生血管變化規(guī)律，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2012年1～12月于上海長(zhǎng)征醫(yī)院胃鏡室，取慢性淺表性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、胃黏膜腸腺化生各20例標(biāo)本；于病理科取胃癌標(biāo)本，包括癌組織、癌旁近端、癌旁遠(yuǎn)端，各20例。癌旁近端組織為取自距胃癌組織邊緣3～5 cm胃黏膜組織，癌旁遠(yuǎn)端組織為取自距胃癌組織邊緣5 cm外胃黏膜組織，病理證實(shí)均無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。入選標(biāo)準(zhǔn)：①慢性淺表性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、胃黏膜腸腺化生符合修訂版悉尼系統(tǒng)[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[9]；③排除放化療病例；④研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者對(duì)受試內(nèi)容完全了解，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

一抗：CD34 antibody（1∶100，Abcam），Anti-VEGFA antibody、Anti-VEGF Receptor 2 antibody（1∶1000、Abcam）；BCA蛋白定量試劑盒（索萊寶）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）；鼠兔通用型超敏二抗PV9001、DAB顯色液（中杉金橋）；中性樹(shù)膠、蘇木精染液、PMSF裂解液（國(guó)藥）；PCR反應(yīng)液（Transistor）；Trizol試劑、引物（Invitrogen公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)SP法

免疫組化SP法常規(guī)脫蠟，水化，除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，抗原修復(fù)，血清封閉，加1∶100一抗，濕盒中于4°C冰箱中保存過(guò)夜，PBS洗5 min×3次，加二抗，濕盒中于37°C溫箱中0.5 h，加DAB顯色劑，水洗終止顯色，蘇木精復(fù)染，逐級(jí)酒精脫水，中性樹(shù)膠封片，晾干拍照。用已知陽(yáng)性的組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每一批實(shí)驗(yàn)均設(shè)有陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

微血管計(jì)數(shù)參考Weidner等[10]的方法。①CD34陽(yáng)性以血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色或棕黃色染色為標(biāo)準(zhǔn)；②微血管計(jì)數(shù)以被染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)；③低倍鏡（100×）下觀察切片，選擇微血管分布最高密度區(qū)，然后在高倍鏡（200×，每個(gè)視野面積為0.785 mm2）下計(jì)數(shù)3個(gè)視野的微血管數(shù)，取其平均值為該例的MVD值。

1.3.2 Western Blot相對(duì)定量法

1.3.2.1 蛋白的預(yù)處理 稱取80～120 mg組織，加5倍體積單去污劑裂解液PMSF，勻漿。12 000 r/min離心，取上清液。使用BCA系統(tǒng)進(jìn)行蛋白初定量。均一化調(diào)平上樣總蛋白質(zhì)量至總體積16 μL。每管樣本中加入上樣緩沖液（含溴酚藍(lán)）。

1.3.2.2 電泳制膜 按目的蛋白大小制取1.0 mm分離、濃縮膠，浸于電泳緩沖液中，注入16 μL預(yù)處理蛋白樣本。30 min 80V電泳后60 min 120 V電泳，將電泳得到的分離膠按以下順序疊放：棉花、3層濾紙、分離膠、承載膜、3層濾紙、棉花，4℃轉(zhuǎn)膜。驗(yàn)證轉(zhuǎn)膜成功后用TBST將麗春紅洗脫。

1.3.2.3 封閉孵育曝光、抗體洗脫 將承載膜浸于5%脫脂牛奶中，搖晃1.5 h。將膜浸于TBST稀釋過(guò)的一抗中，4℃孵育過(guò)夜，清洗膜10 min×3次。將膜浸于TBST稀釋過(guò)的二抗中，室溫孵育1 h，清洗膜10 min×3次。取膜加ECL發(fā)光液，移至曝光袋中。曝光后取片，顯影定影沖洗，此時(shí)X光片上相應(yīng)位置的黑色條帶即為最終結(jié)果。

1.3.2.4 數(shù)據(jù)分析 Western Blot采用NIH Image J計(jì)算灰度值。

1.3.3 RT-PCR相對(duì)定量法

1.3.3.1 mRNA的提取 組織加Trizol試劑后勻漿，12 000 r/min離心后棄沉淀，加氯仿混勻，4℃ 12 000 r/min離心取上層水相至另一離心管中，加異丙醇混勻，4℃ 12 000 r/min離心棄上清，RNA沉于管底，加75%乙醇，振蕩、沉淀，4℃ 8000 r/min離心棄上清，真空干燥5～10 min。用50 μL DEPC高壓處理過(guò)的H2O溶解RNA樣品，55～60℃ 5～10 min。

1.3.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 將提取出的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，成為cDNA模板：在微量離心管中加2 μg總RNA，補(bǔ)充DEPC ddH2O達(dá)11 μL。加50 μmol/L Oligo（dT）12～18 μL，混勻、離心。70℃加熱5 min，將微量離心管插入冰浴1 min。在每管中加RT反應(yīng)液13 μL（混勻分裝），總體積為25 μL，42℃反應(yīng)60 min。cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存。操作以試劑盒說(shuō)明書為準(zhǔn)。

1.3.3.3 PCR實(shí)驗(yàn) 以cDNA為模板，進(jìn)行real time PCR實(shí)驗(yàn)。引物溶解：12 000 r/min離心5 min，用ddH2O溶解，配成2 μmol/L的工作濃度。反應(yīng)液配制：引物常規(guī)終濃度設(shè)為200 μmol/L，采用20 μL中加1 μL的cDNA模板。擴(kuò)增條件：95℃ 5 min→95℃ 5 s→60℃ 30 s→溶解曲線分析。

1.3.3.4 引物序列 RT-PCR引物序列見(jiàn)表1。

1.3.3.5 數(shù)據(jù)分析 在RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)CT值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，CT值是一個(gè)指數(shù)而非線性概念，通過(guò)PCR信號(hào)的對(duì)數(shù)值和循環(huán)數(shù)來(lái)確定，計(jì)算2-ΔCT將統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式的數(shù)據(jù)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用Levene檢驗(yàn)方差齊性，若總體方差齊，則采用多個(gè)樣本均數(shù)的方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若總體方差不齊，則采用Krusakal-Wallis檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下微血管形態(tài)

本研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)CD34，顯微鏡下顯示新生血管陽(yáng)性染色呈棕黃色，表現(xiàn)為分支狀、竇隙狀、芽孢狀、橢圓形及圓形等（圖1，見(jiàn)封三）。不同組織類型胃黏膜微血管形態(tài)不一：胃炎新生血管相對(duì)稀疏，分支狀多，有芽胞狀，無(wú)規(guī)則；胃息肉、胃潰瘍和胃黏膜腸腺化生新生血管稍密集，芽孢狀、橢圓形多，仍無(wú)規(guī)則；胃癌中新生血管明顯密集，多為芽孢狀、橢圓形、圓形，有形成血管腔形狀。

2.2 不同類型組織的微血管密度

在胃病發(fā)展不同時(shí)期，各組織類型胃黏膜新生血管的活躍程度，胃癌最高，其次為癌旁近端，癌旁遠(yuǎn)端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍均高于胃炎，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；而癌旁遠(yuǎn)端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 不同類型組織的VEGF-A/VEGFR-2表達(dá)

在胃病發(fā)展不同時(shí)期，通過(guò)Western blot和RT-PCR檢測(cè)各組織類型胃黏膜中VEGF-A和VEGFR-2蛋白及基因的表達(dá)（表3、圖2），結(jié)果顯示，胃癌組織最高，其次為癌旁近端，癌旁遠(yuǎn)端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍高于胃炎，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；而癌旁遠(yuǎn)端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。此結(jié)果與微血管生成情況一致。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同組織類型胃黏膜中新生血管的活躍程度、VEGF-A和VEGFR-2的表達(dá)，胃癌最高，癌旁近端次之，癌旁遠(yuǎn)端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍高于胃炎，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；而癌旁遠(yuǎn)端、胃息肉、胃黏膜腸腺化生、胃潰瘍兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。以上結(jié)果說(shuō)明MVD隨著組織惡性轉(zhuǎn)化傾向存在遞增趨勢(shì)，VEGF-A/VEGFR-2信號(hào)通路對(duì)新生血管具有調(diào)控作用。

在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，新生血管為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧。目前為止已知的腫瘤促血管因子有10余種， VEGF信號(hào)通路是調(diào)控新生血管的關(guān)鍵信號(hào)通路，其中VEGF-A主要參與腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)，與其相應(yīng)的受體VEGFR-2結(jié)合后，激活下游信號(hào)通路，增加血管通透性，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促使血管生成[11]。文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌組織中VEGF/VEGFR2、MVD表達(dá)高于癌旁組織[12-13]，與本研究結(jié)果一致。提示VEGF-A/VEGFR-2信號(hào)通路可誘導(dǎo)胃癌組織新生血管的生成。

胃癌發(fā)生過(guò)程中可能經(jīng)歷慢性淺表性胃炎、胃潰瘍、腸腺化生、胃息肉和癌變等不同階段，微血管生成貫穿在胃黏膜病變的不同時(shí)期。本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-A/VEGFR-2信號(hào)通路對(duì)新生血管具有調(diào)控作用，抑制微血管生成可能具有阻斷胃黏膜惡性病變的作用，從而預(yù)防胃癌發(fā)生。

本研究尚存在許多不足之處，如樣本量少（每組只有20例）、未進(jìn)行干預(yù)措施等。未來(lái)建議擴(kuò)大樣本量，給予相應(yīng)的干預(yù)措施，進(jìn)一步探討胃黏膜病變不同時(shí)期微血管生成情況及VEGF/VEGFR2的表達(dá)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Douglas H，Robert A. Hallmarks of Cancer：The Next Generation [J].Cell，2011，144： 646-674.

[2] Jacques P，F(xiàn)rédéric D，Nathalie M. Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression [J]. Nature，2006，441：437-443.

[3] Liu YH，Ren XY. Expression of MVD，VEGF and CXCR-4 in human colon cancer and their significance [J]. Shanxi Med J，2012，41（6）：542-543.

[4] Zhou HF，Wu J. Expression and clinical significance of VEGF，bFGF and MVD in breast cancer [J]. Journal of Harbin Medical University，2012，46（3）：248-252.

[5] Li Q，Huang B. Expression of CD44v6 and its Relationship with Microvessel Density and Biological Behaviour in Gastric Carcinoma [J]. Progress in Modern Biomedicine，2012，9（12）：1686-1689

[6] 李學(xué)成，盧斌，王宗華，等.胃癌組織內(nèi)miR-29a與VEGF-A表達(dá)的相關(guān)性研究[J].腫瘤學(xué)雜志，2013，（1）：38-41.

[7] 田小林，羅慶偉.胃癌中VEGF-A、VEGF-D和podoplanin的表達(dá)及其與淋巴道轉(zhuǎn)移的研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，49（5）：61-65.

[8] Dixon MF，Robert MG，John HY，et al. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis，Houston 1994 [J]. Am J Surg Pathol，1996，20：1161-1181.

[9] 武忠弼，楊光華.中華外科病理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：655：661.

[10] Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al. Tumor angiogenesis：a new significant independent prognostic indicator in earlystage breast carcinoma [J]. J Nail Cancer lnst，1992， 84（9）：1875-1887.

[11] Byrne AM，Bouchier-hayes DJ，Harmey JH. Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor（VEGF）[J]. J Cell Mol Med，2005，9（4）：777-794.

[12] 龍輝，吳清明，李歡.VEGF的表達(dá)及其微血管密度在胃癌組織中的意義[J].世界華人消化雜志，2010，（6）：557-562.

[13] 劉新蘭，段瑜，魏建敏.Ang-2、Tie-2和VEGFR-2在胃癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012， 34（12）：1279-1281.

（收稿日期：2014-08-10 本文編輯：程 銘）

[3] Liu YH，Ren XY. Expression of MVD，VEGF and CXCR-4 in human colon cancer and their significance [J]. Shanxi Med J，2012，41（6）：542-543.

[4] Zhou HF，Wu J. Expression and clinical significance of VEGF，bFGF and MVD in breast cancer [J]. Journal of Harbin Medical University，2012，46（3）：248-252.

[5] Li Q，Huang B. Expression of CD44v6 and its Relationship with Microvessel Density and Biological Behaviour in Gastric Carcinoma [J]. Progress in Modern Biomedicine，2012，9（12）：1686-1689

[6] 李學(xué)成，盧斌，王宗華，等.胃癌組織內(nèi)miR-29a與VEGF-A表達(dá)的相關(guān)性研究[J].腫瘤學(xué)雜志，2013，（1）：38-41.

[7] 田小林，羅慶偉.胃癌中VEGF-A、VEGF-D和podoplanin的表達(dá)及其與淋巴道轉(zhuǎn)移的研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，49（5）：61-65.

[8] Dixon MF，Robert MG，John HY，et al. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis，Houston 1994 [J]. Am J Surg Pathol，1996，20：1161-1181.

[9] 武忠弼，楊光華.中華外科病理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：655：661.

[10] Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al. Tumor angiogenesis：a new significant independent prognostic indicator in earlystage breast carcinoma [J]. J Nail Cancer lnst，1992， 84（9）：1875-1887.

[11] Byrne AM，Bouchier-hayes DJ，Harmey JH. Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor（VEGF）[J]. J Cell Mol Med，2005，9（4）：777-794.

[12] 龍輝，吳清明，李歡.VEGF的表達(dá)及其微血管密度在胃癌組織中的意義[J].世界華人消化雜志，2010，（6）：557-562.

[13] 劉新蘭，段瑜，魏建敏.Ang-2、Tie-2和VEGFR-2在胃癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012， 34（12）：1279-1281.

（收稿日期：2014-08-10 本文編輯：程 銘）

[3] Liu YH，Ren XY. Expression of MVD，VEGF and CXCR-4 in human colon cancer and their significance [J]. Shanxi Med J，2012，41（6）：542-543.

[4] Zhou HF，Wu J. Expression and clinical significance of VEGF，bFGF and MVD in breast cancer [J]. Journal of Harbin Medical University，2012，46（3）：248-252.

[5] Li Q，Huang B. Expression of CD44v6 and its Relationship with Microvessel Density and Biological Behaviour in Gastric Carcinoma [J]. Progress in Modern Biomedicine，2012，9（12）：1686-1689

[6] 李學(xué)成，盧斌，王宗華，等.胃癌組織內(nèi)miR-29a與VEGF-A表達(dá)的相關(guān)性研究[J].腫瘤學(xué)雜志，2013，（1）：38-41.

[7] 田小林，羅慶偉.胃癌中VEGF-A、VEGF-D和podoplanin的表達(dá)及其與淋巴道轉(zhuǎn)移的研究[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，49（5）：61-65.

[8] Dixon MF，Robert MG，John HY，et al. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis，Houston 1994 [J]. Am J Surg Pathol，1996，20：1161-1181.

[9] 武忠弼，楊光華.中華外科病理學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：655：661.

[10] Weidner N，F(xiàn)olkman J，Pozza F，et al. Tumor angiogenesis：a new significant independent prognostic indicator in earlystage breast carcinoma [J]. J Nail Cancer lnst，1992， 84（9）：1875-1887.

[11] Byrne AM，Bouchier-hayes DJ，Harmey JH. Angiogenic and cell survival functions of vascular endothelial growth factor（VEGF）[J]. J Cell Mol Med，2005，9（4）：777-794.

[12] 龍輝，吳清明，李歡.VEGF的表達(dá)及其微血管密度在胃癌組織中的意義[J].世界華人消化雜志，2010，（6）：557-562.

[13] 劉新蘭，段瑜，魏建敏.Ang-2、Tie-2和VEGFR-2在胃癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012， 34（12）：1279-1281.

（收稿日期：2014-08-10 本文編輯：程 銘）