劉毅++++++李志樑++++++江騰春++++++傅強(qiáng)

[摘要] 目的 研究黃芪多糖（APS）對(duì)2型糖尿?。═2DM）患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（cEPCs）數(shù)量及功能的影響。 方法 選擇廣州市從化區(qū)中醫(yī)醫(yī)院2013年10月～2014年5月間住院治療的確診為T2DM的患者69例，分為APS治療組（36例）和常規(guī)治療組（33例）。APS治療組在降糖治療的基礎(chǔ)上增加APS治療2周，常規(guī)治療組僅給予常規(guī)西藥降糖治療。觀察T2DM患者治療前后cEPCs的數(shù)量及功能變化。 結(jié)果 APS治療組中T2DM患者治療后cEPCs數(shù)量顯著增加，與治療前及常規(guī)治療組治療后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；同時(shí)APS治療組中T2DM患者治療后cEPCs黏附功能、遷移功能、增殖功能顯著改善，與治療前及常規(guī)治療組治療后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 APS治療可增加T2DM患者cEPCs的數(shù)量且伴隨著cEPCs功能的改善。

[關(guān)鍵詞] 黃芪多糖；糖尿病；內(nèi)皮祖細(xì)胞

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）12（a）-0008-04

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是由多種致病因素作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退和胰島素抵抗等引起的一種代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖和糖尿?yàn)橹饕卣?，典型DM患者可出現(xiàn)多飲、多尿以及消瘦等癥狀。DM的慢性并發(fā)癥不僅嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，更是導(dǎo)致其傷殘、死亡的主要原因。已有相關(guān)研究報(bào)道DM并發(fā)癥的病理生理學(xué)改變主要是源自微血管病變和大血管病變，并且血管內(nèi)皮損傷是DM血管病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)和病理生理基礎(chǔ)[1]。黃芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是中藥黃芪中的主要活性成分，既往體外實(shí)驗(yàn)[2-3]揭示其具有促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖以及改善內(nèi)皮功能等作用，從而可能有效干預(yù)DM血管內(nèi)皮損傷的發(fā)病過(guò)程。本研究是通過(guò)短期內(nèi)給予2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者足療程APS治療，從而探討APS對(duì)T2DM患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞（circulating endothelial progenitor cells，cEPCs）數(shù)量及功能的影響。旨在為APS在DM慢性并發(fā)癥的臨床治療中提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對(duì)象的選擇及排除標(biāo)準(zhǔn) 選擇2013年10月～2014年5月間在廣州市從化區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)一科住院治療且確診為T2DM的患者69例，分為APS治療組（36例）和常規(guī)治療組（33例）。T2DM診斷參照1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：高血壓、糖尿病等慢性疾病控制不佳；合并糖尿病并發(fā)癥；合并結(jié)締組織疾病、心血管系統(tǒng)疾病等影響EPCs的因素；既往有他汀類藥物降脂治療史；炎癥、近期外傷、手術(shù)史；對(duì)黃芪多糖皮試陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)均征得患者本人書面同意。所有研究過(guò)程均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.1.2 藥物干預(yù) APS治療組在普通西藥降糖治療的基礎(chǔ)上，每日通過(guò)靜脈滴注途徑加用注射用APS（商品名：伯恩，國(guó)藥準(zhǔn)字220040086，天津賽諾制藥有限公司）250 mg，療程為2周；常規(guī)治療組僅給予常規(guī)西藥降糖治療。為防止受試患者因既往使用APS對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響，需確保所有入選受試者在參與研究前1個(gè)月內(nèi)均無(wú)使用APS治療。

1.2 材料與試劑

本研究全部實(shí)驗(yàn)依托于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心血管實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)所需材料及試劑包括：人纖維連接蛋白（human fibronectin protein，HFN），購(gòu)自美國(guó)BD公司；Transwell小室，購(gòu)自美國(guó)康寧公司；Dil標(biāo)記乙酰化低密度脂蛋白（Dil-AcLDL），購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；EGM-2MV培養(yǎng)基，購(gòu)自瑞士LONZA公司；二苯基四氮唑溴鹽（MTT）以及FITC標(biāo)記荊豆凝集素Ⅰ（FITC-UEA-Ⅰ），均購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；單個(gè)核細(xì)胞分離液，購(gòu)自天津?yàn)笊镏破饭?；Hanks平衡鹽溶液，購(gòu)自北京索萊寶科技公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素，均購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所。

1.3 方法

1.3.1 EPCs的分離與培養(yǎng) 對(duì)入選參與研究的病例均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周血10 mL，肝素抗凝后加入Hanks平衡鹽溶液1∶1混勻，沿試管壁緩慢加入20 mL單個(gè)核細(xì)胞分離液，使用水平離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）以2000 r/min離心20 min后獲取所需要的單個(gè)核細(xì)胞并使用PBS洗滌2次，經(jīng)調(diào)整細(xì)胞懸液濃度后，將單個(gè)核細(xì)胞接種于包被有HFN的培養(yǎng)板上，加入EGM-2MV培養(yǎng)基（含20%胎牛血清以及青霉素、鏈霉素各100 U/mL）培養(yǎng)EPCs。

1.3.2 EPCs的鑒定 換液培養(yǎng)至第7天，使用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞后，將細(xì)胞爬片與Dil-AcLDL（24 μg/mL）于37℃條件下孵育1 h，用倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）觀察EPCs對(duì)Dil-AcLDL的攝取。確定染色效果后用2%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，固定后用PBS浸洗，加入FITC-UEA-Ⅰ（10 μg/mL）繼續(xù)于37℃條件下孵育1 h。通過(guò)共聚焦顯微鏡（LSCM，德國(guó)Zeiss公司）鑒定Dil-AcLDL和FITC-UEA-Ⅰ雙染色陽(yáng)性細(xì)胞即為正在分化的EPCs。采用倒置熒光顯微鏡對(duì)隨機(jī)選擇的5個(gè)視野進(jìn)行EPCs計(jì)數(shù)。

1.3.3 EPCs黏附功能檢測(cè) 使用0.25%的胰酶消化收集培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，用EGM-2MV培養(yǎng)液吹打均勻，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。將等量EPCs接種于包被有HFN的培養(yǎng)板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min，然后隨機(jī)選取3個(gè)顯微鏡視野計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞。

1.3.4 EPCs遷移功能檢測(cè) 收集貼壁EPCs用于制備細(xì)胞懸液，將Transwell小室（上室與下室間以8.0 μm孔徑的硝酸纖維膜分離開）每下室分別加入600 μL的EGM-2MV培養(yǎng)液，并將100 μL的EPCs細(xì)胞懸液加入上室。將加入EPCs的Transwell小室放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室，經(jīng)PBS清洗后，用棉簽去除微孔膜上層的細(xì)胞。用4%多聚甲醛固定已侵入并貼附于微孔膜下層的細(xì)胞，Giemsa染色后隨機(jī)選擇3個(gè)顯微鏡視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，用于評(píng)價(jià)EPCs的遷移能力。

1.3.5 EPCs增殖功能檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)EPCs增殖能力。首先制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，將等量的EPCs懸液接種于96孔板培養(yǎng)，每孔100 μL并加入MTT（5 g/L）20 μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。之后取出棄上清液，向每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，于微量振蕩器振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，然后置全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定各孔吸收OD值，用于評(píng)價(jià)EPCs增殖能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的鑒定

由分離獲取的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)7 d后在顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭型。通過(guò)共聚焦顯微鏡鑒定Dil-AcLDL（紅色，激發(fā)波長(zhǎng)為543 nm）和FITC-UEA-Ⅰ（綠色，激發(fā)波長(zhǎng)為477 nm）雙染色陽(yáng)性（呈黃色）細(xì)胞即為正在分化的EPCs（圖1，見封三），于倒置熒光顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野（倒置熒光顯微鏡，200×）進(jìn)行計(jì)數(shù)并比較。

2.2 APS對(duì)T2DM患者cEPCs數(shù)量及黏附功能、遷移功能、增殖功能的影響

兩組患者在治療前cEPCs的數(shù)量及功能差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0. 05）；常規(guī)治療組在治療前后cEPCs的數(shù)量及功能無(wú)明顯改變（P > 0.05）；APS治療組患者經(jīng)過(guò)為期2周的療程后，cEPCs的數(shù)量顯著增加且cEPCs各功能均明顯改善，與治療前及常規(guī)治療組治療后比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表1。

2.3 不良反應(yīng)

兩組患者在研究進(jìn)行過(guò)程中，均未有嚴(yán)重不良反應(yīng)。個(gè)別患者使用后出現(xiàn)皮膚紅斑、瘙癢、蕁麻疹等過(guò)敏反應(yīng)，但短期內(nèi)均可自行消失。

3 討論

近年來(lái)T2DM的發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)，DM作為一種嚴(yán)重危害人體健康的慢性疾病，已成為世界性公共問(wèn)題，其血管病變導(dǎo)致的并發(fā)癥不僅嚴(yán)重影響DM患者生活質(zhì)量，并且是DM患者致死致殘的主要原因。有相關(guān)報(bào)道表明約70%的T2DM患者死于DM血管并發(fā)癥。EPCs是一類能增殖并分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可增加缺血組織新生血管形成，并能夠促進(jìn)損傷內(nèi)膜的再內(nèi)皮化，在修復(fù)受損內(nèi)皮并維持正常的內(nèi)皮功能方面起著極為重要的作用。目前已有研究揭示血管內(nèi)皮損傷是DM血管病變的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)[1]。而DM損傷內(nèi)皮功能的主要病理生理學(xué)機(jī)制是高血糖及其氧化代謝產(chǎn)物抑制血管內(nèi)皮NO生成[4]，抑制EPCs分化并促其凋亡[5]，EPCs受損后釋放大量炎癥因子介導(dǎo)血管內(nèi)膜的炎性反應(yīng)[6]。

黃芪是由豆科植物蒙古黃芪及膜夾黃芪的干燥塊莖入藥，其味甘，性微溫，歸肺脾二經(jīng)，中醫(yī)治療上具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、利尿脫毒以及斂瘡生肌等功效。作為一味藥用歷史悠久的傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，目前臨床上常用于糖尿病、冠心病等慢性疾病的中醫(yī)輔助用藥。APS是從中藥黃芪中分離提取出來(lái)的一種大分子化合物，具有較強(qiáng)的生物活性，是黃芪的主要活性成分之一，具有降低血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化以及調(diào)控血糖等作用[7-9]。有相關(guān)動(dòng)物研究揭示APS可改善DM的物質(zhì)代謝以及延緩DM慢性并發(fā)癥的病程[10]。

徐寒松等[11]在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，一定濃度范圍內(nèi)APS對(duì)DM患者EPCs的增殖具有促進(jìn)作用，且與APS劑量、使用時(shí)間呈依賴關(guān)系，其具體作用機(jī)制可能是通過(guò)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑達(dá)成[12]。同時(shí)APS能夠促使EPCs分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[3]參與受損血管內(nèi)皮再生。提示APS參與血管內(nèi)皮損傷修復(fù)，并且可以促進(jìn)EPCs增殖及分化。

本研究通過(guò)對(duì)比APS治療組在西藥降糖的基礎(chǔ)上短期加用足療程APS治療及常規(guī)治療組的單純降糖對(duì)癥治療在T2DM患者中的作用。研究結(jié)果證實(shí)，短期足療程APS治療可以顯著增加T2DM患者cEPCs的數(shù)量，同時(shí)也能夠顯著改善其cEPCs的黏附能力、遷移能力、增殖能力，與常規(guī)治療相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

綜上所述，血管內(nèi)皮損傷在T2DM合并血管病變的慢性并發(fā)癥中扮演著重要角色，而T2DM患者短期足療程使用APS治療可明顯增加其cEPCs的數(shù)量且伴隨著cEPCs功能的顯著改善，為短期APS治療在T2DM患者慢性并發(fā)癥的應(yīng)用上提供了初步依據(jù)。但APS改善DM患者cEPCs數(shù)量及功能的具體作用機(jī)制，仍有待于進(jìn)一步的探討和研究。同時(shí)由于本次研究的樣本量相對(duì)較少，尚需增加樣本量使研究結(jié)果更確切。

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（收稿日期：2014-08-21 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-08-21 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-08-21 本文編輯：程 銘）