孫 穎 ，劉 儒 ，羅 敏 ，李建安

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜336600)

油桐Tunglfy基因在花芽分化期對(duì)不同外源激素的分子響應(yīng)

孫 穎1，劉 儒2，羅 敏1，李建安1

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 亞熱帶林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，江西 分宜336600)

為了探索不同外源激素對(duì)油桐花芽分化過程中關(guān)鍵成花基因表達(dá)的影響，采用不同種類、不同濃度梯度的外源激素在未分化期進(jìn)行葉片噴施處理，分析研究對(duì)油桐成花基因Tunglfy基因表達(dá)量的差異，以期為油桐花期調(diào)控的分子生物學(xué)研究提供支撐和依據(jù)。結(jié)果表明：外施6-芐基腺嘌呤對(duì)Tunglfy基因表達(dá)均有抑制作用，整個(gè)花芽分化進(jìn)程中較對(duì)照都降低了Tunglfy基因表達(dá)量。不同濃度赤霉素對(duì)Tunglfy基因的表達(dá)有著不同的影響，高濃度赤霉素對(duì)Tunglfy基因的表達(dá)具有抑制作用，而低濃度則起到促進(jìn)作用。脫落酸的50 mg/L和200 mg/L對(duì)Tunglfy基因的表達(dá)有較強(qiáng)的抑制作用，而100 mg/L對(duì)Tunglfy基因的表達(dá)均有明顯的促進(jìn)作用。

油桐；Tunglfy基因；外源激素；花芽分化

長(zhǎng)期以來研究者普遍認(rèn)為高等植物花芽分化與植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)水平存在密切關(guān)系，而后的一系列研究結(jié)果表明，植物的內(nèi)源激素也在一定程度上影響著植物成花[1-4]。有關(guān)油桐花芽分化研究已有相關(guān)報(bào)道[5-8]，如李建安等人對(duì)油桐花芽分化期生理基礎(chǔ)研究等[6]。

細(xì)胞分裂素有促進(jìn)植物花芽分化作用，黃迪輝等研究表明在蘋果生理分化轉(zhuǎn)向形態(tài)分化期間進(jìn)行摘葉試驗(yàn)，減少了花芽的形成[9]。內(nèi)源細(xì)胞分裂素的增加可以促進(jìn)蘋果開花，KoshitaY等研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源激素對(duì)成花的作用[10]。部分學(xué)者認(rèn)為脫落酸對(duì)花芽分化具有促進(jìn)作用，如錢樺等[11]發(fā)現(xiàn)6-芐基腺嘌呤促進(jìn)石斛花芽分化作用；但部分學(xué)者并不這樣認(rèn)為，如王玉華等[12]在研究發(fā)現(xiàn)脫落酸對(duì)花芽分化具有一定的抑制作用。因此，脫落酸對(duì)花芽分化的影響目前還處于探索階段[13]。大量研究表明赤霉素對(duì)植物成花表現(xiàn)抑制作用，任小林[14]等、王媛等[15]、黎維詩(shī)[16]等均在自己的研究中發(fā)現(xiàn)赤霉素對(duì)花芽分化具有顯著抑制作用。

在成花調(diào)控途徑中，LFY基因位是可見的花器官形成的“開關(guān)”基因，LFY基因表達(dá)量到達(dá)一定之后調(diào)控AP1等下游基因的表達(dá)，植物進(jìn)行可見花器官的發(fā)育[17]。本文通過對(duì)油桐花芽分化期內(nèi)6-芐基腺嘌呤、脫落酸、赤霉素對(duì)Tunglfy基因表達(dá)的影響的研究，進(jìn)一步為油桐的花期化學(xué)調(diào)控提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

6月上中旬，在湖南省林科院天際嶺林場(chǎng)，選擇樹體健壯、無(wú)病蟲害的植株，在天氣晴好的上午進(jìn)行葉面噴施處理，每種激素設(shè)4個(gè)處理（包括對(duì)照），隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，單株小區(qū)，重復(fù)3次。噴施的濃度分別為，6-芐基腺嘌呤：25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L；赤霉素：50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L；脫落酸：25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L；對(duì)照噴等量清水。

于7月底至9月底，每隔10天采集幼芽2～4個(gè)/次/株。采后液氮暫存帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80°超低溫冰箱保存，以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

花芽分化時(shí)期劃分參照《油桐LFY同源基因的克隆及花芽分化生理基礎(chǔ)研究》[18]；總RNA采用改良CTAB法提取[19]，并將其提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃冰箱中保存用于后續(xù)試驗(yàn)。內(nèi)參基因Actin引物：ActinF1：5'-GCAACTGGGATGATATGGGT-3'；ActinR1：5'-AGATAGGAG -GTAATGTGCCG-3'；Tunglfy基 因 引 物：LFYA1：5’-CATATGCTACTTATCCC TAACCTAC-3’；LFYS1：5’-TGACGAACCAGGT GTTTAG -GTATGC-3’。反應(yīng)體系為：12.5 μL的Easy Taq Mix；正反向引物 (10 μmol)各 1.0 μL，模 板 cDNA1.0 μL，ddH2O 是 9.5μL， 總 體 積 5μL。反應(yīng)條件：94℃變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，27個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存[19]。采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖表分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取RNA的質(zhì)量分析

樣品經(jīng)液氮研磨后，在傳統(tǒng)CTAB法的基礎(chǔ)上，分別加入含PVP-40、巰基乙醇的5%的CTAB裂解液，氯仿∶異戊醇=24∶1進(jìn)行抽提，離心后取清液加入異丙醇沉淀RNA。

圖1 不同方法的油桐總RNA提取效果比較Fig.1 Comparison of RNA extraction effects with different methods

由圖1可以看出，傳統(tǒng)CTAB法得的RNA28S與18S條帶亮度淡，表明總RNA的濃度較低，獲得量少； 而改良CTAB法所獲得的RNA28S與18S條帶清晰且二者比例接近2∶1；表明其提取效果較好。經(jīng)BIO-RAD SmartSpec plus 核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)其OD值，260/280約為1.9～2.02，提取質(zhì)量符合RT-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)要求。

2.2 Tunglfy 基因外源激素信號(hào)的分子響應(yīng)

在整個(gè)花芽分化期，油桐Tunglfy基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，隨著花芽分化的進(jìn)行，在萼片原基形成期Tunglfy基因相對(duì)表達(dá)量最大為2.03，在雌蕊原基形成期Tunglfy基因相對(duì)表達(dá)量為最低值為0.25，如圖2所示。

2.2.1Tunglfy基因6-芐基腺嘌呤信號(hào)的分子響應(yīng)

花芽形態(tài)分化開始后，25 mg/L濃度梯度的油桐Tunglfy基因相對(duì)表達(dá)量不斷降低，在花瓣原基形成期出現(xiàn)最低值0.17。隨之相對(duì)表達(dá)量呈快速上升趨勢(shì)，在雄蕊原基形成期達(dá)到整個(gè)分化時(shí)期的最大值1.18。整個(gè)花芽形態(tài)分化過程中6-芐基腺嘌呤 25 mg/L濃度處理后的Tunglfy基因相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照，但在雌蕊原基形成期高于對(duì)照?？梢?5 mg/L濃度處理在一定程度上抑制成花關(guān)鍵基因Tunglfy的表達(dá)。

圖2 Tunglfy基因?qū)?-芐基腺嘌呤信號(hào)的分子應(yīng)答Fig.2 Molecular response of Tunglfy gene to 6-BA

50 mg/L濃度處理下，油桐Tunglfy基因在花序分化期相對(duì)表達(dá)量達(dá)到2.08，隨后Tunglfy基因相對(duì)表達(dá)量迅速下降，但花瓣原基形成期基因相對(duì)表達(dá)量開始上升。在整個(gè)花芽形態(tài)分化期間，50 mg/L處理也使Tunglfy基因的表達(dá)高峰提前到花序分化期，同時(shí)油桐Tunglfy基因相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照，但在雌蕊原基形成期高于對(duì)照?？芍?0 mg/L處理對(duì)Tunglfy基因的表達(dá)具有一定的抑制作用。

雌蕊原基形成期100 mg/L濃度處理后的油桐Tunglfy基因達(dá)到表達(dá)最大值為1.57。隨后Tunglfy基因相對(duì)表達(dá)量開始迅速下降，在萼片原基形成期達(dá)到最低值。之后Tunglfy相對(duì)表達(dá)量逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。整個(gè)分化階段內(nèi)100 mg/L濃度處理處理油桐Tunglfy表達(dá)量與對(duì)照比較均低于對(duì)照，但在雌蕊原基形成期高于對(duì)照。由此看見100 mg/L對(duì)Tunglfy基因的表達(dá)具有一定的抑制作用且延遲了Tunglfy基因的表達(dá)表達(dá)高峰期到花芽分化中雌蕊原基形成階段。

2.2.2Tunglfy基因脫落酸信號(hào)的分子響應(yīng)

在油桐花芽花序分化開始后，噴施50 mg/L脫落酸的花芽中Tunglfy基因表達(dá)量開始緩慢上升，在雄蕊原基分化期時(shí)達(dá)到1.36，在整個(gè)形態(tài)分化期中為最大值。在雄蕊分化期后一直處于下降的趨勢(shì)。與對(duì)照比較發(fā)現(xiàn)，在形態(tài)分化期間，50 mg/L處理的油桐花芽中Tunglfy基因表達(dá)量均低于對(duì)照，說明該濃度對(duì)油桐Tunglfy基因的表達(dá)具有抑制作用。

圖3 Tunglfy基因?qū)γ撀渌嵝盘?hào)的分子應(yīng)答Fig.3 Molecular response of Tunglfy gene to abscisic acid

脫落酸100 mg/L處理的Tunglfy基因在花序分化期至萼片原基分化期的表達(dá)量變化差異較小，在花瓣原基分化期迅速攀升至最大值2.21而超過對(duì)照處理。花萼原基分化期至花瓣原基分化期，Tunglfy基因的表達(dá)量開始下降，與對(duì)照基本吻合。隨后，基因表達(dá)量再次上升，雄蕊原基分化期后變化平穩(wěn)，表達(dá)量水平高于對(duì)照。從花萼分化期開始，脫落酸100 mg/L處理的Tunglfy基因表達(dá)量都處在高于對(duì)照的水平，說明脫落酸100 mg/L處理對(duì)油桐Tunglfy基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用。

脫落酸100 mg/L處理的Tunglfy基因表達(dá)量呈現(xiàn)于對(duì)照相反的趨勢(shì)，從花序原基分化期開始，基因表達(dá)量開始上升，在花萼原基分化期達(dá)到第一個(gè)峰值，隨后開始下降，在花瓣原基分化期下降到最低值。從花瓣原基分化期至雄蕊原基分化期逐漸上升，在雄蕊原基分化期后，保持平穩(wěn)表達(dá)水平。在分化過程中，Tunglfy基因表達(dá)處于較低的水平，說明脫落酸200 mg/L處理對(duì)油桐Tunglfy基因的表達(dá)具有抑制作用。

脫落酸3個(gè)濃度梯度對(duì)油桐Tunglfy基因表達(dá)的影響分析，脫落酸對(duì)油桐Tunglfy基因表達(dá)的促進(jìn)作用還是抑制作用是與脫落酸濃度存在一定關(guān)聯(lián)，本研究中高濃度（200 mg/L）或低濃度（50 mg/L）脫落酸處理均對(duì)Tunglfy基因的表達(dá)起到抑制作用。

2.2.3Tunglfy基因赤霉素信號(hào)的分子響應(yīng)

在花序分化期至雄蕊原基分化期，赤霉素50 mg/L和100 mg/L處理對(duì)油桐Tunglfy基因表達(dá)的影響基本一致，從花序分化期開始迅速上升，并在花萼原基分化期時(shí)達(dá)到最大值。與對(duì)照比較發(fā)現(xiàn)，油桐Tunglfy基因表達(dá)高峰期提前?；ㄝ嘣只诤蠡虮磉_(dá)量迅速下降，在花瓣原基分化期達(dá)到最小值，在此之后，50 mg/L處理在雄蕊原基分化期達(dá)到第二峰值，隨后開始下降。

圖4 Tunglfy基因?qū)Τ嗝顾匦盘?hào)的分子應(yīng)答Fig.4 Molecular response of Tunglfy gene to gibberellic acid

赤霉素200 mg/L處理對(duì)Tunglfy基因表達(dá)的影響則表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。赤霉素200 mg/L處理下Tunglfy基因表達(dá)量最大值出現(xiàn)在雄蕊分化期，晚于對(duì)照，說明200 mg/L處理具有推遲開花的作用。

總之，50 mg/L和100 mg/L的赤霉素、100 mg/L的脫落酸均有使Tunglfy基因表達(dá)量最大值提前，進(jìn)而在不同程度上促進(jìn)油桐花芽分化作用；6-芐基腺嘌呤的3個(gè)濃度、200 mg/L的赤霉素、50 mg/L、200 mg/L的脫落酸噴施后有不同程度的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)材料油桐花芽含有較多的次生代謝物尤其是多糖、多酚，而酚類物質(zhì)可RNA純度，多糖形成難溶物質(zhì)而不利于RNA分離。傳統(tǒng)CTAB法的材料研磨、裂解后上清液上有粘稠液體覆蓋，可能是多糖和多酚物質(zhì)未去除干凈，從而影響RNA提取質(zhì)量。經(jīng)電泳檢測(cè)，28S上方有明顯拖帶，多糖等有機(jī)物仍有殘留，而且RNA的OD260/OD280小于1.3，無(wú)法滿足半定量RT-PCR的要求。而本文在傳統(tǒng)CTAB法的基礎(chǔ)上，分別加入含PVP-40、巰基乙醇的5%的CTAB裂解液，氯仿∶異戊醇=24∶1進(jìn)行抽提，離心后取清液加入異丙醇沉淀RNA。能夠有效的去除多糖等大分子有機(jī)物，經(jīng)電泳檢測(cè)多糖等物質(zhì)殘留較少，可以滿足半定量的要求。

植物細(xì)胞分裂素對(duì)成花有促進(jìn)作用，整個(gè)成花階段中花芽形態(tài)分化期，體內(nèi)的細(xì)胞分裂素水平達(dá)到最高。相關(guān)研究表明6-芐基腺嘌呤的濃度在400 mg/L能有效提前石斛的花芽分化時(shí)間[16]，與本論文中研究50 mg/L結(jié)論相同。但也有研究表明在非誘導(dǎo)短日下細(xì)胞分裂素抑制它的開花[17]。這可能是因?yàn)?-芐基腺嘌呤對(duì)成花影響與植物種類、立地條件等有關(guān)系。脫落酸在花芽分化中起著不同的作用，即一些植物中有效的促進(jìn)花芽分化還有一些植物中抑制花芽分化。本研究結(jié)果表明，脫落酸對(duì)油桐花芽分化的促進(jìn)和抑制作用是表現(xiàn)在不同濃度上的，其中100 mg/L是促進(jìn)作用而其他兩個(gè)濃度則表現(xiàn)抑制作用。大量研究表明赤霉素對(duì)植物成花具有抑制作用。本文中200 mg/L的赤霉素處理的研究結(jié)果一致，但50 mg/L、100 mg/L處理則使Tunglfy基因表達(dá)高峰提前，促進(jìn)提前開花，這與王媛等[15]研究結(jié)果基本相同。由此可見，赤霉素對(duì)植物成花時(shí)間影響還需要進(jìn)一步研究。本論文僅對(duì)3種激素的各自影響，在生產(chǎn)實(shí)踐中可能是兩種或者多種激素混合噴施，因此不同激素種類組合、不同濃度激素組合等交互作用及其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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Molecular response ofTunglfygene to exogenous hormones in fl ower buds differentiation period

SUN Ying1, LIU Ru2, LUO Min1, LI Jian-an1
(1.The Key Lab of Cultivation and Protection for Non-wood Forest Tree of Education Ministry , Central South University of Forestry and Technology ,Changsha 410004, Hunan, China; 2. Experimental Centre of Subtropical Forestry of CAF, Fenyi 336600, Jiangxi, China)

In order to explore different exogenous hormones on key flowering genes expression inAleurites fordiiflower bud differentiation process, the leaves spraying treatments were conducted by adopting exogenous hormones with different types and concentrations in the undifferentiated stage, and the differences of exogenous hormones on fl owering genes expression levels ofTunglfygenes were investigated, thus providing support and basis for molecular biology research of control the fl owering phase. The results show that the applying 6-benzyladenine to the buds had inhibitory action onTunglfygene expression, in the entire process of fl ower bud differentiation, the treated lowered down more the amount ofTunglfygene expression than the control; There were differences among different concentrations of gibberellic acid onTunglfygene expressions, the high concentrations of gibberellic acid onTunglfyhad inhibitory effect toTunglfygene expression, while the low concentrations played a facilitating role. The treatments with abscisic acid of 50 mg/L and 200 mg/L had strong inhibition toTunglfygene expression, and 100 mg/L forTunglfygene expression had obvious promoting role.

Vernicia fordii;Tunglfygene; exogenous hormones; fl ower bus differentiation

S794.3

A

1673-923X(2014)04-0025-05

2013-11-12

國(guó)家林業(yè)局行業(yè)公益性專項(xiàng)基金“紅壤丘陵區(qū)經(jīng)濟(jì)林生態(tài)經(jīng)營(yíng)關(guān)鍵技術(shù)研究”（201104052）；湖南省研究生創(chuàng)新基金“赤霉素對(duì)油桐成花調(diào)控”（CX2012B320）

孫 穎（1983-），女，遼寧鐵嶺人，博士研究生，研究方向：主要從事經(jīng)濟(jì)林培育研究

李建安（1964-），男，湖南茶陵人，教授，博導(dǎo)，研究方向：主要從事經(jīng)濟(jì)林培育研究；E-mail：lja0731@126.com

[本文編校：吳 彬]