王 娜 ， 商志偉 ， 趙 敏

（1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院 學(xué)生工作部，黑龍江 哈爾濱150066；3.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院 食品工程系，黑龍江 哈爾濱 150066）

近年來，關(guān)于動(dòng)物腸道微生態(tài)的研究日益受到人們重視。一方面，人們?cè)噲D從腸道微生態(tài)角度尋求作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑——抗生素的替代品[1]；另一方面，動(dòng)物腸道被認(rèn)為是人腸道研究的理想模型[2]。而能夠調(diào)控動(dòng)物腸道微生物平衡、增殖有益菌、抑制有害菌，從而提高動(dòng)物健康水平的微生態(tài)制劑（probiotics）[3]正日益受到人們的關(guān)注。有研究報(bào)道，合理利用微生態(tài)制劑，可以有效地減少仔豬斷奶應(yīng)激的發(fā)生，仔豬飼喂微生態(tài)制劑后，其可有效定植在仔豬腸道內(nèi)[4]，能提高動(dòng)物腸道中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性[5]，并能夠調(diào)節(jié)腸道菌群，使在仔豬腸道中對(duì)宿主健康起有益作用的細(xì)菌數(shù)量大幅提高［6］，還可以有效抑制致病菌的生長(zhǎng)，維持腸道正常的生態(tài)平衡[7-8]，預(yù)防和治療仔豬腹瀉[9]。此外，其無殘留、無毒副作用等特點(diǎn)，可改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，使養(yǎng)殖生產(chǎn)良性發(fā)展，取得更好的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益[10]。動(dòng)物腸道環(huán)境不斷變化，并且受多種因素影響，在益生菌的配制方面，一般認(rèn)為混合菌制劑有益于微生物間的互補(bǔ)，效果較好。Collado等[11]將幾種不同乳酸菌進(jìn)行了復(fù)配，并對(duì)其腸道抑菌效果進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果表明，混合菌株的效果好于單獨(dú)菌株。Sanders等［12］研究不同益生菌屬、種和菌株對(duì)宿主的益生作用，也發(fā)現(xiàn)復(fù)合的菌株或菌種比單一菌株更有效。

在本研究中，作者首次將蠟樣芽孢桿菌、戊糖乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等進(jìn)行混合，通過飼喂斷奶仔豬，研究其對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響，再進(jìn)一步研究微生態(tài)制劑在仔豬腸道定植情況及其對(duì)腸道菌群的影響，旨在深入了解微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)可能的調(diào)控機(jī)制，為菌種的合理搭配和復(fù)合微生物制劑的生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微生態(tài)制劑

蠟樣芽孢桿菌，由作者所在試驗(yàn)室從健康斷奶仔豬糞便中分離并鑒定，現(xiàn)存于東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室；鼠李糖乳桿菌（CICC6159）、戊糖乳桿菌（CICC 21809），購(gòu)置于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

戊糖乳桿菌培養(yǎng)基配方為：1 g/dL乳糖+廢糖蜜，0.5 g/dL棉粕粉，0.3 g/dL磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉；蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)基為：0.5 g/dL蔗糖+0.5 g/dL廢糖蜜，1 g/dL棉粕粉，0.3 g/dL氯化鈉；鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)基配方為：1 g/dL乳糖+廢糖蜜，0.5 g/dL棉粕粉，0.3 g/dL磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉。

分別發(fā)酵戊糖乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌，將發(fā)酵液以8 000 g離心10 min得菌泥，向菌泥中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%葡萄糖溶液作為保護(hù)劑，再拌入適量滅菌干燥的稻殼粉（3種益生菌活菌數(shù)≧1×1010cfu/g），低溫干燥，得活菌制劑，檢測(cè) 3種活菌制劑活菌數(shù)（活菌數(shù)≧1×109cfu/g）后備用，將制備好的3種菌制劑以1∶1∶1體積比例混合即得混合微生態(tài)制劑。

1.2 飼養(yǎng)管理及動(dòng)物試驗(yàn)

試驗(yàn)于大慶市泰康縣康泰公司種豬場(chǎng)進(jìn)行，選用 28 日齡，初始平均體質(zhì)量為（8.20±0.22）kg 的“杜長(zhǎng) 大”三元雜交健康（無腹瀉）斷奶仔豬24頭，仔豬隨機(jī)分為兩組（對(duì)照組和試驗(yàn)組），每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭仔豬。以玉米-豆粕型日糧，營(yíng)養(yǎng)需要參照英瑞斯企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)（表1），飼料為粉料。對(duì)照組飼喂正常粉料，試驗(yàn)組采用粉料拌食質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%混合微生態(tài)菌制劑（飼料活菌數(shù)≧1×109cfu/kg）為日糧。試驗(yàn)期為63 d（試驗(yàn)組飼喂微生態(tài)制劑56 d+飼喂正常粉料 7 d），每日 8∶00、13∶00、19∶00 喂食，自由飲水；每次飼喂直至料槽剩余少許飼料為止，準(zhǔn)確記錄每日每個(gè)重復(fù)組仔豬日供料量、剩余料量和損失料量，每7 d對(duì)兩組仔豬逐只空腹稱質(zhì)量。試驗(yàn)期間，每日8∶00定時(shí)觀察仔豬糞便情況（是否存在糞質(zhì)稀薄，水分增加，或含未消化食物或膿血、黏液）。記錄腹瀉頭數(shù)及次數(shù)，計(jì)算腹瀉率。腹瀉率=（總腹瀉次數(shù)/（總頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)））×100%。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Basic diet formula and nutrition levels

1.3 糞便收集

試驗(yàn)期間，每7 d一次于晨8∶00對(duì)各重復(fù)組仔豬逐只直腸取便少許 （約10 g），立刻放入無菌管中，于-80℃冰箱保存，備用。

1.4 糞樣中pH值測(cè)定

分別取不同時(shí)間點(diǎn)備用糞樣2 g，加入l0 mL蒸餾水，混勻后靜置5 min，用酸度計(jì)測(cè)定pH值。

1.5 PCR法檢測(cè)仔豬糞便益生菌相對(duì)含量

1.5.1 細(xì)菌基因組提取及引物設(shè)計(jì) 分別取不同時(shí)間點(diǎn)備用糞樣2 g，放入組織粉碎機(jī)中磨碎，加5 mL無菌磷酸緩沖液稀釋，充分混勻，取2 mL勻漿，采用solarbio細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌種基因組DNA。在GenBank上查找蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌菌株的16S rDNA序列，然后利用 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）設(shè)計(jì)屬內(nèi)特異性引物，上下游引物序列見表2。

表2 蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌特異性引物Table 2 Primer sequences for genes in Bacillus cereus，Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus pentosus

1.5.2 PCR法檢測(cè)樣品糞便蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌相對(duì)含量 PCR程序參考陳津津[13]等方法并加以改進(jìn)：10×PCR Buffer，25 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPS， 上下游引物 0.2 （μmol/L）/0.2（μmol/L），DNA模板1μL，1.25UTaq酶（Promega）；反應(yīng)條件：94℃變性3 min；循環(huán)35次；94℃變性40 s，55℃退火20 s，72℃延伸 75 s；72℃延伸5 min。

1.6 DGGE分析微生態(tài)制劑對(duì)仔豬腸道菌群的影響

選取斷奶當(dāng)天，斷奶后7、14、21、28 d和63 d收集的兩組仔豬糞樣供DNA提取，方法同上。

利用一對(duì)細(xì)菌通用的引物 F933-954：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC GGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG -3’，R1369-1388：5’-GCCCGGGAACGTATTCACCG-3’對(duì)細(xì)菌的16S rDNA的V6—V8區(qū)片段進(jìn)行PCR反應(yīng)[14]。DGGE用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%聚丙烯酰胺凝膠，尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度30%～50%，電泳緩沖液為0.5×TAE，先200 V恒壓電壓預(yù)電泳10 min，隨后在85 V電壓電泳10～12 h。電泳結(jié)束后，用銀染法進(jìn)行染色，顯色定影后干燥過夜，觀察染色效果并照相。

將DGGE凝膠圖譜上的特殊條帶進(jìn)行回收，以8 f和1 510 r[15]作為PCR引物用于引導(dǎo)細(xì)菌16S rDNA全序列的擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，與PMD-18T質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中，將轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，序列的同源性通過互聯(lián)網(wǎng)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。

1．7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生態(tài)制劑對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

仔豬斷奶時(shí)由于環(huán)境、飼料、消化生理和免疫等因素的改變，易使斷奶仔豬產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，出現(xiàn)消化吸收功能異常，消化道正常微生物區(qū)系紊亂，導(dǎo)致腹瀉和生長(zhǎng)發(fā)育受阻[16]。由表3可知，喂食微生態(tài)制劑可以促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng)，降低料質(zhì)量比和腹瀉率。在喂食微生態(tài)制劑前兩周時(shí)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組仔豬頭平均日增質(zhì)量增加35%，平均料質(zhì)量比降低9.04%，腹瀉率下降37.04%；喂食3～4周時(shí)，仔豬頭平均日增質(zhì)量增加26.32%，平均料質(zhì)量比降低7.7%，腹瀉率下降26.32%；喂食5～8周時(shí)，頭平均日增質(zhì)量增加10.71%，平均料質(zhì)量比降低7.7%，腹瀉率下降12.03%。說明微生態(tài)制劑對(duì)仔豬生產(chǎn)性能的影響具有顯著的時(shí)間效應(yīng)，在仔豬斷奶初期微生態(tài)制劑對(duì)仔豬的影響最顯著。

本研究中，飼喂混合微生態(tài)菌制劑2周后頭平均日增質(zhì)量增加35%，平均料質(zhì)量比降低9.04%，腹瀉率下降37.04%，與黃麗彬[17]和王海東[18]等研究相比較，此混合微生態(tài)菌制劑效果更佳，這可能是由于本微生態(tài)制劑中的菌種間發(fā)生協(xié)調(diào)作用，相互促進(jìn)各自在腸道內(nèi)的有益作用，使其益生效果更加明顯。

2.2 微生態(tài)制劑對(duì)仔豬糞樣pH值的影響

通常認(rèn)為，糞便的pH值可部分反映動(dòng)物消化道中的酸堿程度。pH值偏酸，反映消化道環(huán)境有利于有益微生物的生長(zhǎng)，而偏堿則反映對(duì)有害微生物有利，產(chǎn)生腹瀉的概率較大[19]。

由圖1可知，試驗(yàn)期間，由于斷奶的影響，在對(duì)照組中，仔豬糞便pH呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，直到35 d后pH值才逐漸恢復(fù)到斷奶當(dāng)日水平。試驗(yàn)組仔豬糞樣pH始終較對(duì)照組低，且基本保持在斷奶水平。

表3 微生態(tài)制劑對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 3 Effents of compound probiotic on growth performance of weaning piglet

圖1 微生態(tài)制劑對(duì)仔豬糞便pH值的影響Fig.1 Effents of compound probiotic on pH of weaning pigle

圖1說明，通過飼喂本微生態(tài)制劑使仔豬消化道保持偏酸性環(huán)境，可利于有益微生物的生長(zhǎng)。有研究表明，腸道中的酸性環(huán)境有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，可提高飼料利用率，這點(diǎn)恰好與微生態(tài)制劑促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)性能相吻合。

2.3 糞便中3種目標(biāo)益生菌相對(duì)含量變化分析

研究表明，對(duì)糞便微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可以反映目標(biāo)益生菌在腸道內(nèi)定植過程的演變規(guī)律[20]。圖 2（a）（b）（c）各為飼喂微生態(tài)菌制劑后跟蹤檢測(cè)3種目標(biāo)益生菌——蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌于仔豬體內(nèi)相對(duì)于斷奶當(dāng)日變化情況。結(jié)果表明，由于斷奶的影響，對(duì)照組中兩種乳酸桿菌在仔豬斷奶初期顯著降低，而試驗(yàn)組中3目標(biāo)菌數(shù)量均明顯高于對(duì)照組，隨喂食時(shí)間的延長(zhǎng)試驗(yàn)組中3種目標(biāo)菌在腸道內(nèi)的含量有增加的趨勢(shì)，并且在停喂一周后，糞樣中仍存在此3種益生菌，且數(shù)量較飼喂時(shí)無明顯變化。說明，在飼喂8周后微生態(tài)制劑中益生菌已成功定植到仔豬消化道中，可以幫助減緩斷奶時(shí)仔豬消化道內(nèi)乳酸菌的變化，維持其腸道的穩(wěn)定性。

圖2 仔豬糞便中3種益生菌隨時(shí)間變化情況Fig.2 Changes of Bacillus cereus，Lactobacillus rhamnosus，and Lactobacillus pentosus on flora in weanling piglets over time

有研究表明，益生菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)可通過定植繁殖來維持消化道有益菌的優(yōu)勢(shì)作用，并與腸道中的病原菌及潛在的致病菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制有害菌的生長(zhǎng)[21-22]，提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力[23]，進(jìn)一步促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng)。

2.4 微生物制劑對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響

利用DGGE技術(shù)對(duì)斷奶仔豬糞樣菌群進(jìn)行跟蹤研究，結(jié)果見圖3，并將特殊條帶摳膠測(cè)序，見表4。

圖3 仔豬糞樣細(xì)菌16S rDNA的V6-V8區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE圖譜Fig.3 Bacterial DGGE profiles generated from V6-V8 16S rDNA fragments of piglets fecal samples

結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌均存在于飼喂益生菌的仔豬糞樣中，且此3益生菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組，這與qPCR結(jié)果相一致，再次說明3種益生菌成功定植在仔豬腸道內(nèi)。并且，本微生態(tài)制劑可以通過增加宿主腸道益生菌（X1、X5、X6、X7、X12和X13）的數(shù)量及減少有害菌（X9和X10）的方式來調(diào)節(jié)腸道功能。如蠟樣芽孢桿菌X1，是一種兼性厭氧菌，可以在腸道內(nèi)短時(shí)間定植，消耗大量的氧，維持腸道厭氧環(huán)境，有益于厭氧的乳酸菌的生長(zhǎng)；X6、X7和X13均為乳酸菌，眾所周知，乳酸菌是動(dòng)物腸道中常見的益生菌，其在抑制動(dòng)物腸道有害細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，抵抗病原茵的感染，代謝產(chǎn)生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有機(jī)酸，刺激腸道蠕動(dòng)，抑制腸道腐敗，提高抗病能力等方面，都有著重要的作用。所以認(rèn)為，添加本微生態(tài)制劑可創(chuàng)造出有利于乳酸菌生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境，通過增殖腸道益生菌的數(shù)量來調(diào)節(jié)仔豬腸道菌群的平衡，進(jìn)而緩解仔豬斷奶應(yīng)激反應(yīng)及促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)。

表4 圖3中DGGE圖譜中特異性條帶的16S rDNA序列分析及物種鑒定Table4 16S rDNA sequenceanalysisand species identification ofselected dominant DGGE bands in Fig.3

3 結(jié)語

在本文所述試驗(yàn)條件下，飼喂微生態(tài)制劑可以通過在仔豬消化道內(nèi)定植益生菌來增加斷奶仔豬日增質(zhì)量，降低料質(zhì)量比和腹瀉率，維持仔豬腸道中pH值的穩(wěn)定，促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)繁殖，抑制有害菌的生長(zhǎng)；并且，此微生態(tài)制劑對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響有時(shí)間效應(yīng)，在仔豬斷奶初期效果最佳。

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