樊 英，李 樂，于曉清，李天保，王淑嫻，刁 菁，王勇強(qiáng)

(山東省海洋生物研究院病害與漁藥研究中心，山東青島266002)

近年來，隨著我國北方仿刺參養(yǎng)殖業(yè)的大力發(fā)展以及南方海參越冬的開發(fā)，海參已成為最大的養(yǎng)殖品種之一［1］.然而，隨著海參養(yǎng)殖的規(guī)?；⒓s化發(fā)展，海參病害的發(fā)生頻率及程度越來越高，這些已受到研究者和養(yǎng)殖者的重視.自海參“腐皮綜合癥”發(fā)生以來，尋求綠色環(huán)保、無公害的免疫增強(qiáng)劑便成為預(yù)防海參疾病發(fā)生的研究熱點(diǎn).仿刺參屬棘皮動(dòng)物，非特異性免疫是抵御外來侵害的重要途徑.免疫增強(qiáng)劑可通過提高機(jī)體的非特異性免疫來增強(qiáng)對(duì)外界病害的抵抗力，對(duì)機(jī)體本身是安全的.目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的免疫增強(qiáng)劑主要有細(xì)菌提取物、動(dòng)植物提取物、化學(xué)合成物質(zhì)和維生素等［2－5］.黃芪多糖和枸杞多糖是多糖類免疫增強(qiáng)劑中研究較多且較深入的植物源免疫多糖，它們通過作用于機(jī)體的多靶點(diǎn)而促進(jìn)非特異性免疫力的提高，同時(shí)能夠增強(qiáng)腸道內(nèi)菌群的變化而提高自身的免疫功能［6］;黃柏等作為常用的抗菌中草藥已被認(rèn)可，具有抗病毒、抑制有害免疫反應(yīng)的作用［7］;菊粉和天蠶素等天然物質(zhì)的免疫作用已被重視，研究表明，它們不但能從營養(yǎng)學(xué)方面增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，而且能夠從免疫學(xué)方面提高抗病力［8－9］.這些免疫增強(qiáng)劑對(duì)仿刺參的免疫作用尚未見報(bào)道.本試驗(yàn)采用植物提取物作為免疫增強(qiáng)劑，研究其對(duì)仿刺參免疫功能的影響，旨在為仿刺參免疫增強(qiáng)劑及配合飼料添加劑的研發(fā)提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參購于山東青島王哥莊某養(yǎng)殖場(chǎng)，初始體重為(30±2)g.PMSF、NBT和EGTA購于Sigma公司.

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與管理

正式試驗(yàn)前，仿刺參于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7 d.飼喂量按仿刺參的攝食情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以達(dá)到飽食投喂，每天于9:00和15:00投喂，投喂前吸除殘餌和糞便，同時(shí)補(bǔ)充新鮮海水.試驗(yàn)期間連續(xù)充氣，水溫控制在(14±0.5) ℃，鹽度 32‰，pH 7.8－8.2，溶解氧含量 ＞5 mg·L－1.

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

暫養(yǎng)結(jié)束，仿刺參饑餓24 h后分苗稱重.挑選個(gè)體均勻的健康仿刺參放到不同的試驗(yàn)桶中，隨機(jī)分為7組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只仿刺參，試驗(yàn)期7 d.各免疫試驗(yàn)組仿刺參體腔分別注射500 μL 1.0 mg·mL－1黃柏提取物、苦參提取物、枸杞多糖提取物、黃芪多糖提取物、菊粉和天蠶素等6種免疫增強(qiáng)劑;對(duì)照組注射相同體積的無菌生理鹽水.注射后第1、3和5天在每個(gè)桶中隨機(jī)挑取3只仿刺參分別從其肛門處抽取體腔液進(jìn)行免疫指標(biāo)的測(cè)定.

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 體腔細(xì)胞總數(shù)量(total coelomocytes counts，TCC)的測(cè)定 體腔液與抗凝劑(含0.02 mol·L－1EGTA、0.48 mol·L－1NaCl、0.019 mol·L－1KCl和 0.068 mol·L－1Tris-HCl，pH 7.6)按 1∶1 的體積比充分混合，電子顯微鏡下通過血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行體腔細(xì)胞計(jì)數(shù).于5000 r·min－1、4℃離心8 min，棄上清液，沉淀物迅速用 4 ℃冰凍的等滲緩沖液(含 0.001 mol·L－1EGTA、0.53 mol·L－1NaCl和 0.01 mol·L－1Tris-HCl，pH 7.6)調(diào)整TCC達(dá)到2×106個(gè)·mL－1.取600 μL體腔細(xì)胞懸液用于體腔細(xì)胞產(chǎn)量的測(cè)定，其余樣品用于酶活性的測(cè)定.

1.4.2 體腔細(xì)胞破碎物上清液(coelomic supernatant，CLS)的制備 體腔細(xì)胞樣品于4℃加入0.1 mmol·L－1PMSF，用超聲波(輸出22 kHz、0 ℃)勻漿6 s，于10000 r·min－1、4 ℃離心8 min，所得CLS 用于免疫指標(biāo)的測(cè)定.

1.4.3 呼吸爆發(fā)活性的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取200 μL體腔細(xì)胞懸液，加入等體積的2 mg·mL－1NBT(溶解在含 2%NaCl的 Tris-HCl中，pH 7.6)，室溫下避光反應(yīng)1 h，于500 r·min－1離心5 min，棄上清液.用等滲緩沖液洗滌后加入200 μL甲醇，室溫固定10 min，于800 r·min－1離心8 min，棄上清液.用50%甲醇洗滌3次，棄上清液于室溫下晾干.干燥后加入240 μL 2 mol·L－1KOH和280 μL DMSO，充分溶解后測(cè)定630 nm波長處的光密度(D).

1.4.4 吞噬活性的測(cè)定 取100 μL抗凝體腔液放入96孔板中，貼壁30 min后棄上清液.加入100 μL 0.001 mol·L－1中性紅溶液，室溫下吞噬30 min，用生理鹽水洗掉未被吞噬的中性紅，加入100 μL細(xì)胞裂解液(冰醋酸與無水乙醇按1∶1的體積比配制)，裂解20 min，測(cè)定540 nm波長處的D.以試驗(yàn)條件下每106個(gè)體腔細(xì)胞對(duì)應(yīng)的D來表示吞噬活性.

1.4.5 酚氧化酶(phenol oxidase，PO)活性的測(cè)定 取 50 μL 制備的 CLS 樣品和 50 μL 0.1 mg·mL－1胰蛋白酶放入96孔板中，充分混勻，室溫下溫育10 min，加入50 μL 3 mg·mL－1左旋多巴(L-DOPA)，室溫下溫育10 min，測(cè)定495 nm波長處的D.以試驗(yàn)條件下每毫升樣品每分鐘D每增加0.001定義為一個(gè)PO活性單位，單位:U·mL－1.

1.4.6 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)活性的測(cè)定CLS樣品中的SOD和ACP活性采用試劑盒(南京建成公司)測(cè)定.每毫升樣品在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD活性為1個(gè)SOD活性單位，單位:U·mL－1;每毫升樣品在30 min產(chǎn)生1 mg游離酚為1個(gè)CLS活性單位，單位:U·mL－1.

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，若差異顯著，則用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，顯著性水平為P＜0.05.

2 結(jié)果與分析

從圖1可以看出:注射后第1天，免疫試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，枸杞多糖提取物對(duì)仿刺參的TCC無顯著影響，其他免疫試驗(yàn)組的TCC均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);注射后第3天，黃柏提取物和菊粉組的TCC分別達(dá)到15×106和14×106個(gè)·mL－1，與對(duì)照組的差異顯著(P＜0.05);注射后第5天，各免疫試驗(yàn)組的TCC均出現(xiàn)不同程度的下降，且與對(duì)照組的差異不顯著，以黃柏提取物和菊粉組的TCC最高.

圖1 免疫增強(qiáng)劑對(duì)仿刺參TCC、呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性的影響Fig.1 TCC，respiratory burst and phagocytosis activity of A.japonicus injected different diets

從圖1可以看出:注射后第1天，只有苦參提取物對(duì)仿刺參的呼吸爆發(fā)活性產(chǎn)生顯著影響(P＜0.05)，其他免疫試驗(yàn)組與對(duì)照組的差異不顯著;注射后第3天，菊粉組的呼吸爆發(fā)活性與對(duì)照組的差異最顯著(P＜0.05)，其次是黃柏提取物組(P＜0.05);注射后第5天，各免疫試驗(yàn)組的呼吸爆發(fā)活性相當(dāng)，但均與對(duì)照組的差異顯著(P＜0.05)，呼吸爆發(fā)活性與時(shí)間不呈正比.

從圖1可以看出:注射后第1天，只有苦參提取物對(duì)仿刺參的吞噬活性產(chǎn)生顯著影響(P＜0.05);注射后第3天，各免疫增強(qiáng)劑對(duì)吞噬活性產(chǎn)生的效果不同，菊粉和苦參提取物組與對(duì)照組的差異最顯著(P＜0.05)，D540nm達(dá)0.4，其次是黃芪多糖提取物組;注射后第5天，黃芪多糖提取物和苦參提取物組吞噬活性的下降趨勢(shì)緩慢，其他免疫試驗(yàn)組下降趨勢(shì)明顯.

從圖2可以看出:枸杞多糖提取物和天蠶素組仿刺參的PO活性在注射后的第1天產(chǎn)生最大變化;黃柏提取物和菊粉組的PO活性則在注射后的第3天產(chǎn)生最大變化，且效果最顯著(P＜0.05);黃芪多糖提取物和苦參提取物組的PO活性在注射后的第5天產(chǎn)生最大變化，而其他免疫試驗(yàn)組的PO活性隨著時(shí)間的延長發(fā)生下降趨勢(shì).

圖2 免疫增強(qiáng)劑對(duì)仿刺參PO、SOD和ACP活性的影響Fig.2 PO，SOD and ACP activity of A.japonicus injected different diets

從圖2可以看出:注射后第1天，免疫試驗(yàn)組仿刺參的SOD活性與對(duì)照組的差異顯著(P＜0.05)，且達(dá)到最大值，其中以菊粉組的效果最顯著，SOD活性為97 U·mL－1，而天蠶素組則在注射后的第5天達(dá)到最大值;試驗(yàn)期間各免疫試驗(yàn)組SOD活性的變化趨勢(shì)平穩(wěn).

從圖2可以看出:注射后第1天，各免疫試驗(yàn)組仿刺參的ACP活性與對(duì)照組相比無顯著變化;注射后第3天，枸杞多糖提取物、黃柏提取物和菊粉組與對(duì)照組的差異顯著，以黃柏提取物組的效果最顯著，ACP活性達(dá)0.065 U·mL－1;注射后第5天，黃芪多糖提取物組的ACP活性驟然提高，達(dá)到0.062 U·mL－1，而其他免疫試驗(yàn)組的ACP活性呈下降趨勢(shì)，與對(duì)照組的差異不顯著(P＞0.05).

3 討論

3.1 免疫增強(qiáng)劑對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞功能的影響

仿刺參的體腔細(xì)胞是抵御外來侵害的第一道防線和關(guān)鍵部分.體腔細(xì)胞可通過自我和非自我的識(shí)別、吞噬、包裹形成排除異物，體現(xiàn)吞噬功能的變化，直接參與免疫反應(yīng)［10］.經(jīng)免疫增強(qiáng)劑激活后的體腔細(xì)胞可以產(chǎn)生很多活性氧殺菌物質(zhì)，如H2O2和等，能夠提高機(jī)體的抗病力［2，11－14］.本試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫增強(qiáng)劑能在不同程度上影響仿刺參的TCC，且激活體腔細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性和吞噬活性.黃柏提取物和菊粉顯著刺激仿刺參體腔細(xì)胞繁殖分裂，TCC增加，從而提高仿刺參的免疫力;而苦參提取物對(duì)TCC未發(fā)生顯著影響，其對(duì)仿刺參免疫力的改變與TCC無相關(guān)性，這與Zhao et al［15］的研究結(jié)果相似;苦參提取物顯著提高仿刺參體腔細(xì)胞的吞噬活性，與對(duì)照組的差異顯著，且隨著時(shí)間的延長下降趨勢(shì)緩慢，其次是菊粉和黃芪多糖提取物組，這可能與不同免疫增強(qiáng)劑的作用機(jī)制有關(guān).

3.2 免疫增強(qiáng)劑對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞免疫酶活性的影響

對(duì)缺乏特異性免疫的棘皮動(dòng)物來說，PO系統(tǒng)在免疫防御中起著重要作用.Zhao et al［15］研究表明，2.50 g·kg－1β-葡聚糖對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞PO活性的影響最顯著，間接提高仿刺參的免疫力和抗病力;張琴等［3］研究表明，飼料中不添加VE時(shí)，刺參的PO活性隨著硒酵母添加量的增加而上升，飼喂不同劑量的VE對(duì)PO活性的影響不顯著.本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃柏提取物和菊粉在注射后第3天對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞PO活性的影響最顯著，而苦參提取物對(duì)PO活性的影響不顯著.這可能由不同免疫增強(qiáng)劑激活PO原系統(tǒng)的作用不同，或仿刺參體腔細(xì)胞對(duì)不同免疫增強(qiáng)劑的受體不同造成的.

SOD是衡量生物體健康狀況的一個(gè)主要指標(biāo)，機(jī)體內(nèi)SOD活性的高低反映抗氧化能力的大?。?，13，16］.張琴等［3］研究表明，飼料中添加 100 和 200 mg·kg－1甘草酸可以顯著提高刺參體腔細(xì)胞的 SOD活性.本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同免疫增強(qiáng)劑對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞SOD活性產(chǎn)生不同的影響，反映機(jī)體對(duì)不同免疫增強(qiáng)劑的刺激產(chǎn)生不同的承受能力，應(yīng)對(duì)外界的抗氧化能力及抵御敵害的免疫力發(fā)生不同的變化.

ACP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，也是巨噬細(xì)胞最有代表的水解酶之一［17－18］.本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同免疫增強(qiáng)劑對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞ACP活性產(chǎn)生不同的影響，且出現(xiàn)最大值的時(shí)間不同，這可能與不同免疫增強(qiáng)劑的成分及結(jié)構(gòu)有關(guān).

3.3 免疫增強(qiáng)劑的研究進(jìn)展

目前國內(nèi)外已報(bào)道多種免疫增強(qiáng)劑具有增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物免疫功能的作用，但針對(duì)仿刺參的研究較少，且一般集中在多糖類物質(zhì)(如肽聚糖、寡糖、脂多糖和免疫多糖等)、營養(yǎng)素類物質(zhì)(如VC和VE等)和益生菌制劑上［19－23］.Gu et al［24］通過體外試驗(yàn)研究不同免疫增強(qiáng)劑對(duì)仿刺參體腔細(xì)胞功能影響的結(jié)果表明:β-葡聚糖、寡甘露聚糖(MOS)和未甲基化的寡聚脫氧核苷酸 (CpG-ODN)均能顯著提高仿刺參的吞噬活性、呼吸爆發(fā)活性、SOD和總一氧化氮酶(T-NOS)活性;而乳鐵蛋白只能提高呼吸爆發(fā)活性和SOD活性，對(duì)吞噬活性和總一氧化氮酶活性沒有顯著影響;VC則提高了SOD和總一氧化氮酶活性，對(duì)吞噬活性和呼吸爆發(fā)活性未產(chǎn)生顯著影響.

本試驗(yàn)選取的菊粉在自然界分布廣泛，主要來源于植物，具有穩(wěn)定性等特征，主要由呋喃果糖以β-2，1-D-糖苷鍵連接形成，能夠增殖有益菌，調(diào)節(jié)腸道功能，促進(jìn)礦物質(zhì)元素的吸收，抑制內(nèi)毒素等物質(zhì)的產(chǎn)生，激發(fā)免疫活性，提高免疫功能等.本試驗(yàn)中，菊粉可提高仿刺參的免疫力，驗(yàn)證了上述功能.中草藥黃柏具有抗菌、抗病毒和促進(jìn)消化系統(tǒng)胰腺分泌等作用.本試驗(yàn)中黃柏提取物增強(qiáng)仿刺參的免疫功能可以從這些方面進(jìn)行解析，對(duì)仿刺參產(chǎn)生的免疫抑制作用與其自身具有的免疫應(yīng)答抑制效果相關(guān).由于中草藥的藥理作用復(fù)雜，其具體的刺激作用需要更加深入的探究.中草藥免疫增強(qiáng)劑長期服用可引起免疫疲勞［25］，持續(xù)投喂時(shí)免疫指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生下降的趨勢(shì).改變投喂方式，將多種免疫增強(qiáng)劑交替使用或開發(fā)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑是解決免疫疲勞的有效途徑.中草藥免疫增強(qiáng)劑在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)防重于治，其作為一種有效控制疾病的物質(zhì)在水產(chǎn)動(dòng)物尤其在仿刺參病害防治中起著重要作用，具有良好的安全性和可靠性，開發(fā)研制復(fù)合型的長效、高效和速效的新型免疫增強(qiáng)劑已成為發(fā)展的趨勢(shì).

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