孫 武，李宇翔，謝勇平，，黃志堅(jiān)，李清祿，

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院;3.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室，福建福州350002)

伴隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生與蔓延已成為制約漁業(yè)增效、漁民增收的關(guān)鍵問題，其中以細(xì)菌性、病毒性疾病最為嚴(yán)重［1］.如鰻魚、大黃魚、甲魚等各種腸炎，對(duì)蝦的爛鰓、白斑、紅體，甲魚的鰓腺炎、白底板，黃鱔的脫粘、紅頭和大頭病等病癥，導(dǎo)致養(yǎng)殖中所使用的魚用藥物的種類和數(shù)量不斷增多.然而抗生素、促生長(zhǎng)劑和殺蟲藥等的大量使用帶來了藥物殘留大、抗藥性等問題［2］，危害人類健康，污染了環(huán)境，且效果不佳.因此無殘留、無污染的中藥制劑越來越受到重視，應(yīng)用也日益廣泛.

中藥具有天然性、多功能性、無毒副、無殘留性和無抗藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)，尤其是多成分協(xié)同作用和改善生態(tài)微環(huán)境作用［3］.將中藥用于預(yù)防和治療水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病，對(duì)減少魚疾病，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義，也將給我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來深遠(yuǎn)的影響［4］.然而，目前中藥散劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害防治過程中存在的問題和不足也明顯地顯現(xiàn)出來，如臨床用藥效果緩慢、藥效不穩(wěn)定等.可能原因是由于魚類生理學(xué)上的特殊性，使藥物在腸道中的滯留時(shí)間相對(duì)較其他動(dòng)物短，有效成分在動(dòng)物體內(nèi)利用度很低，導(dǎo)致治療效果差;其次可能是中藥有效成分含量變化大，產(chǎn)品質(zhì)量不可控制，藥效不穩(wěn)定.

中藥材浸(提)取液可從根本上克服中藥散劑的弊端.它通過各種現(xiàn)代浸(提)取技術(shù)將中藥材中的有效成分提取分離出來，再根據(jù)需要進(jìn)行復(fù)配，融合了中藥組方和西藥有效成分的理論精髓，其有效成分吸收快速、完全、生物利用度高、療效快，完全可與西藥媲美.中藥顆粒劑就是以此為基礎(chǔ)形成的中藥制劑.中藥顆粒劑在人體上應(yīng)用比較普遍，有較多的優(yōu)勢(shì)，但在魚用藥物方面的應(yīng)用還很少，幾乎是空白.研究表明，由于中藥顆粒劑毒副作用小，既可治病又可作為飼料添加劑預(yù)防疾病，同時(shí)水溶性好，使用方便，是一種較為理想的魚用中藥制劑.

參照中獸醫(yī)理論和中藥使用的經(jīng)驗(yàn)處方，復(fù)方魚用中藥整腸顆粒由黃柏、黃連、白頭翁和秦皮等中藥材組成.根據(jù)方中黃柏、黃連、白頭翁和秦皮的功效特點(diǎn)［5－11］組成方劑，有整腸洗腸、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、改善腸道微環(huán)境、消炎抗病毒的功效.由于方劑中鹽酸小檗堿是抑菌的主要活性成分，本試驗(yàn)以鹽酸小檗堿為考察指標(biāo)，研究黃柏、黃連、白頭翁和秦皮較佳的制備工藝和顆粒產(chǎn)品的穩(wěn)定性、安全性和臨床應(yīng)用的有效性等性能，旨在為制定產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和擴(kuò)大中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

中藥材黃柏、黃連、秦皮和白頭翁等均購于福建同春藥業(yè)有限公司.

菌株:腸型點(diǎn)狀氣單胞菌(Aeromonas punotata f.intestinalis)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)，均來源于農(nóng)業(yè)部漁業(yè)動(dòng)植物病原庫.

試劑有鹽酸小檗堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、超純水，其他試劑均為分析純.

主要儀器與設(shè)備有Waters Breeze 1525高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)、KQ3200DE超聲波清洗器(蘇州昆山市超聲儀器有限公司)、BP211D電子天平(北京塞多利斯天平有限公司)、超凈臺(tái)、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱等.

1.2 產(chǎn)品制備

1.2.1 水提工藝 將105 g白頭翁、150 g黃柏、60 g黃連和50 g秦皮4味藥材混合，根據(jù)4味藥材主成分均為水溶性的特點(diǎn)，提取工藝定為水提.經(jīng)正交試驗(yàn)(略)得到最佳工藝為:將藥材混合加入約12倍的水煎煮2次，每次1 h，濾過.合并濾液并將其濃縮成稠浸膏(80℃熱測(cè)稠浸膏的比重為1.30－1.35)，備用.

1.2.2 顆粒制備 稱取80 g糖粉和80 g糊精倒入適當(dāng)?shù)娜萜髦?，混合均勻，再加?40 g糖粉混合均勻.稱取65 g稠浸膏倒入上述輔料，攪拌均勻，調(diào)整軟材的軟硬度，然后擠壓過12目篩制成濕顆粒.

1.2.3 干燥、整粒 濕顆粒制成后，攤于潔凈的搪瓷盤中，放入烘箱于60－80℃鼓風(fēng)干燥，直至顆粒含水量達(dá)5.0%以下，然后過12目和60目篩進(jìn)行整粒、包裝.

1.3 鹽酸小檗堿含量的測(cè)定

按高效液相色譜(high performance liquid chromatogram，HPLC)法［12］測(cè)定.

1.3.1 色譜條件 固定相:C18 柱，4.6 mm ×250 mm，5 μm;流動(dòng)相:乙腈∶水 =50∶50(1000 mL 溶液中含3.4 g磷酸二氫鉀和1.7 g十二烷基硫酸鈉)，使用前用0.45 μm濾膜抽濾，超聲脫氣30 min;檢測(cè)波長(zhǎng):346 nm;流速:1 mL·min－1;柱溫:30℃;理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2500.

1.3.2 鹽酸小檗堿對(duì)照品和供試品溶液的制備 鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液配成含鹽酸小檗堿50 μg·mL－1.

供試品溶液的配制:取復(fù)方魚用中藥整腸顆粒4 g，研細(xì)，過40目篩，精密稱取篩下物2 g，加入30 mL甲醇，超聲處理15 min，過濾，濾液用甲醇定容至50 mL容量瓶中.精密吸取2 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得.

1.3.3 樣品測(cè)定 將對(duì)照品溶液配成含鹽酸小檗堿含量分別為 0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 和 30.0 μg·mL－1.分別吸取5 μL注入色譜儀，按“1.3.1”的色譜條件測(cè)定峰面積.以鹽酸小檗堿含量對(duì)峰面積進(jìn)行回歸分析得回歸方程.參照對(duì)照品溶液測(cè)定的方法，取供試品溶液5 μL，進(jìn)樣，記錄峰面積，采用回歸方程計(jì)算鹽酸小檗堿的含量.

1.3.4 含量測(cè)定方法的驗(yàn)證 (1)精密度:精密吸取同一鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5針，記錄各進(jìn)針的峰面積.

(2)穩(wěn)定性:精密吸取同一供試品溶液5 μL，分別于0、3、6、12、18和24 h各進(jìn)樣1次，測(cè)定鹽酸小檗堿的峰面積.

(3)重現(xiàn)性:取同一生產(chǎn)批號(hào)的復(fù)方魚用中藥整腸顆粒6份，按“1.3.2”的方法制備樣品液6份，按“1.3.3”的方法測(cè)定樣品鹽酸小檗堿的含量.

(4)加樣回收率:稱取已知含量的復(fù)方魚用中藥整腸顆粒6份，每份2.0000 g，分別加入鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，按“1.3.2”的方法進(jìn)行樣品前處理.按“1.3.3”的方法測(cè)定樣品含量，計(jì)算回收率.

1.4 產(chǎn)品穩(wěn)定性檢測(cè)

1.4.1 光照試驗(yàn) 取3批產(chǎn)品，去除外包裝直接倒入蒸發(fā)皿中，在(4500±500)lx強(qiáng)光下放置，5和10 d后取樣測(cè)定.

1.4.2 溫濕度加速試驗(yàn) 取3批產(chǎn)品，按市售包裝，放置在(40±1)℃、相對(duì)濕度(75±5)%的條件下，每月取樣分析，連續(xù)6個(gè)月.

1.4.3 長(zhǎng)期試驗(yàn) 將3批產(chǎn)品放置于留樣觀察室內(nèi)，室溫下觀察2年，試驗(yàn)期間分別于第3、6、9、12、15、18、21和24個(gè)月時(shí)觀察其性狀、鑒別、含量，并與0個(gè)月的數(shù)據(jù)相比較.

1.5 混飼喂服急性毒性的檢測(cè)

采用半靜水法進(jìn)行.在水族箱中注入充分曝氣的自來水200 L，每個(gè)水族箱分別飼養(yǎng)日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對(duì)蝦20尾.將試驗(yàn)藥物復(fù)方魚用中藥整腸顆粒溶解后均勻拌入飼料中，使藥物濃度分別為10、20和30 g·kg－1，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照.每個(gè)劑量組設(shè)兩個(gè)平行.試驗(yàn)期4 d，投飼量按體重的3%計(jì)，每天1次.試驗(yàn)期間觀察并記錄試驗(yàn)對(duì)象攝食、活動(dòng)和死亡情況.

1.6 對(duì)魚胃腸炎常見病原菌的抑制作用

1.6.1 培養(yǎng)基的配制 取10 g 蛋白胨、5 g 牛肉膏和5 g NaCl，加水至1000 mL，pH 7.2－7.4，于壓力1.05 kg·cm－2、121 ℃下滅菌20 min.

1.6.2 抑菌圈直徑的測(cè)定 采用平板擴(kuò)散法將培養(yǎng)18 h的菌株用無菌水配制成約107cfu·mL－1的菌懸液，移取100 μL菌懸液至肉汁胨固體培養(yǎng)基上，涂布均勻，稍干后鑷取牛津杯放于接種過菌株的平皿培養(yǎng)基表面，滴加200 μL藥物，藥液濃度為1 mg·L－1，于28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑.

1.6.3 最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定 采用對(duì)倍稀釋法測(cè)定.供試藥液濃度配成 5、2.5、1.25、0.625、0.313 和 0.156 μg·mL－1.

1.7 對(duì)魚腸炎病治療效果的檢測(cè)

參照文獻(xiàn)［13］的方法進(jìn)行.造模成功后藥物混飼喂服，飼料中的藥物濃度為3 g·kg－1，連續(xù)投喂5 d，之后投喂正常的飼料，同時(shí)設(shè)定不喂服藥物的對(duì)照.每組放草魚20尾.試驗(yàn)期10 d.

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中鹽酸小檗堿含量的測(cè)定結(jié)果

對(duì)照品和樣品的HPLC色譜圖如圖1所示，雜峰不干擾鹽酸小檗堿吸收峰的測(cè)定.對(duì)照品含量測(cè)定的線性回歸方程:Y=35929X，R=0.9991.鹽酸小檗堿含量在5－30 μg·mL－1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.方法精密度測(cè)定結(jié)果的RSD=0.368%;穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果的RSD=0.397%;重現(xiàn)性測(cè)定結(jié)果的RSD=3.39%;加樣回收率范圍為97.68%－99.36%，平均98.48%，RSD=0.75%(n=6).用該法測(cè)定復(fù)方魚用中藥整腸顆粒樣品6份，鹽酸小檗堿含量平均值為2.02 mg·g－1，RSD=3.38%，說明方法的可信度高.

圖1 復(fù)方魚用中藥整腸顆粒HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of compound Chinese medicinal bowel-care granule

2.2 產(chǎn)品穩(wěn)定性

對(duì)3批產(chǎn)品進(jìn)行了光照試驗(yàn)、加速試驗(yàn)和溫室留樣觀察試驗(yàn)，經(jīng)檢驗(yàn)，性狀、鑒別、含量等各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化，說明本產(chǎn)品穩(wěn)定性較好.

2.3 急性毒性

復(fù)方魚用中藥整腸顆?；祜暦謩e喂服日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對(duì)蝦，結(jié)果表明，在設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對(duì)蝦均未出現(xiàn)死亡及其他異常癥狀.根據(jù)安全濃度=96 h LC50×0.1，計(jì)算復(fù)方魚用中藥整腸顆粒對(duì)日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對(duì)蝦的安全濃度均大于3 g·kg－1.

2.4 抑菌效果

從表1可以看出，1 mg·L－1復(fù)方魚用中藥整腸顆粒對(duì)腸型點(diǎn)狀氣單胞菌、鰻弧菌、溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的平均抑菌圈直徑分別為 15.4、18.5、13.6 和 13.7 mm.

表1 復(fù)方魚用中藥整腸顆粒對(duì)4株病原菌的抑菌圈直徑Table 1 The antibacterial circle measurement of the bowel-care compound granules to 4 pathogenic strains

2.5 MIC 測(cè)定結(jié)果

復(fù)方魚用中藥整腸顆粒對(duì)腸型點(diǎn)狀氣單胞菌、鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的MIC均為0.625 μg·mL－1，對(duì)溫和氣單胞菌的 MIC 為 1.25 μg·mL－1.

2.6 對(duì)魚腸炎病的治療效果

復(fù)方魚用中藥整腸顆粒經(jīng)混飼喂服(每公斤飼料添加3 g)給藥治療后，草魚腹部膨大、紅斑、肛門紅腫突出、離群獨(dú)游、不攝食和死魚等現(xiàn)象明顯減少，到第5天已無死亡個(gè)體，體色發(fā)黑的魚也已少見.藥物保護(hù)率見表2.3個(gè)試驗(yàn)組的保護(hù)率分別為42.9%、35.7%和57.1%，藥物的平均保護(hù)率為45.2%.

表2 草魚的死亡率Table 2 The average mortality of grass carp

3 結(jié)論

復(fù)方魚用中藥整腸顆粒產(chǎn)品的最佳提取工藝流程是經(jīng)過正交試驗(yàn)得出的，本文省略了該試驗(yàn)過程.加速試驗(yàn)和長(zhǎng)期試驗(yàn)的結(jié)果表明產(chǎn)品的穩(wěn)定性較好.采用HPLC法對(duì)復(fù)方魚用中藥整腸顆粒中鹽酸小檗堿的含量進(jìn)行檢測(cè)，其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率均符合要求，可作為復(fù)方魚用中藥整腸顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的參考.

復(fù)方魚用中藥整腸顆粒對(duì)魚常見致病菌——腸型點(diǎn)狀氣單胞菌、鰻弧菌、溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌有較好的抑制作用，混飼喂服對(duì)日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對(duì)蝦的安全濃度均大于3 g·kg－1，對(duì)胃腸炎病有一定的治療效果，可用于魚因細(xì)菌感染產(chǎn)生的急、慢性腸炎的治療.

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