趙念席， 沈廣爽， 石雪芹

(南開大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津300071)

0 引 言

硝酸還原酶(Nitrate Reductase，NR)是高等植物氮代謝的關(guān)鍵酶。植物的氮源主要是無機(jī)氮化物，而無機(jī)氮化物中又以銨鹽和硝酸鹽為主，約占土壤含氮量的1% ～2%，植物吸收銨鹽后可直接用于氨基酸的合成，而如果吸收了硝酸鹽，則必須通過NR 進(jìn)行代謝還原才能被植物利用［1］。另一方面，因?yàn)镹R 與植物吸收利用氮肥有關(guān)，對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響，因而NR 活性被當(dāng)作植物營(yíng)養(yǎng)或農(nóng)田施肥的指標(biāo)之一，也可作為品種選育的指標(biāo)之一，因此關(guān)于NR 活性影響的研究也具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值［2-4］。

基于NR 的重要性，多數(shù)高校會(huì)在本科植物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中安排NR 活性測(cè)定，其中，實(shí)驗(yàn)中一般都會(huì)重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)NR 是一種誘導(dǎo)酶，通常在有NO－3存在時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)NR 的活性，且光照能提高NR 活性。因此，在準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料過程中，注重KNO3誘導(dǎo)過程和光照過程。但我們多年實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)證明:有許多植物材料經(jīng)誘導(dǎo)也很難檢測(cè)到NR 活性，還有一些材料非誘導(dǎo)對(duì)照組和誘導(dǎo)組NR 活性無顯著差別。因而，尋找并確定好的本科實(shí)驗(yàn)材料成為本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)［5-6］，如果選不對(duì)實(shí)驗(yàn)材料會(huì)使整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗，學(xué)生則不能準(zhǔn)確掌握知識(shí)點(diǎn)。然而，隨著科學(xué)的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，關(guān)于NR 活性調(diào)節(jié)的可能機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究。結(jié)果表明:除受到NO－3 底物濃度、光，以及培養(yǎng)環(huán)境因子等方面的影響外［7-9］;在植物N 代謝中，NH+4濃度對(duì)NR 活性也有影響，且對(duì)不同植物的影響方式并不一致［10-12］，但關(guān)于遺傳因素對(duì)NR 活性的影響涉及較少，從而使得本科教學(xué)中將NR 活性的大小和誘導(dǎo)響應(yīng)作為一個(gè)普遍規(guī)律來講解，其實(shí)作為物種選育的指標(biāo)之一，NR 應(yīng)該會(huì)具有物種特異性和品系特異性。因此，對(duì)植物NR 活性的特異性的了解不僅對(duì)提高農(nóng)業(yè)施肥效率等方面具有重要作用，對(duì)學(xué)生探究其原因也具有興趣引導(dǎo)的作用。

隨著高校綜合性實(shí)驗(yàn)的逐漸推進(jìn)，以培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維習(xí)慣，提高分析問題和解決問題的能力為出發(fā)點(diǎn)，我們?cè)谠囼?yàn)教學(xué)改革中設(shè)置綜合實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了不同植物硝酸還原酶對(duì)KNO3誘導(dǎo)的敏感性問題，并進(jìn)一步檢測(cè)了兩種N 源對(duì)其中3 種植物硝酸還原酶誘導(dǎo)敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

本文選擇小麥(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、辣 椒(Capsicum annuum)、白 菜(Beassica pekinensis)、蘿卜(Raphanus sativus)、番茄(Lycopersicon esculintum)、油菜(Brassica campestris)作為本研究所用的實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 幼苗移栽和無土栽培

種子發(fā)芽3 ～4 周后，將這些植物幼苗移栽至1 L培養(yǎng)缸中1 ×Hoagland(缺N 素)營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每種植物6 盆，其中3 盆用于NR 的誘導(dǎo)，另外3 盆作為對(duì)照，分別作好標(biāo)記。

1.3 KNO3 對(duì)植物硝酸還原酶的誘導(dǎo)

3 d 后，在9:00 ～10:00 中向誘導(dǎo)組處理溶液中加入6 mL 1 mol/L KNO3溶液，而向?qū)φ战M中加入6 mL蒸餾水，放置在人工光源400 μmol/(m2·s)下光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)硝酸還原酶活性。2 d 后14:00 ～16:00(選擇此時(shí)間段是希望與學(xué)生上課時(shí)間同步)，用于硝酸還原酶活性的測(cè)定。

1.4 硝酸還原酶活性的測(cè)定

試劑配置參考高玉葆等［2］略作修改，其中磺胺和萘基乙烯胺溶液參考劉亞麗等［13］配置。

每種植物材料在不同處理?xiàng)l件下采集樣品3 份，采用離體法測(cè)定NR 活性。具體方法為:

(1)每組處理樣品分別隨機(jī)選取均勻植物葉片3份，每份0.5 g，于研缽中剪碎置低溫冰箱冰凍30 min，取出置于冰浴中并加少量石英砂及4 mL 提取緩沖液，研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移入離心管中，在4 ℃8 000 r/min 離心5 min，上清液即為粗酶提取液。

(2)從每份粗酶液中吸取2 個(gè)1 mL，其中一份加入0.1 mol/L KNO3磷酸緩沖液和NADH 溶液(0. 1 mol/L pH7.5 磷酸緩沖液溶液配制)，進(jìn)行酶反應(yīng);另一份加入0.1 mol/L KNO3磷酸緩沖液和0.1 mol/L pH7.5 磷酸緩沖液溶液而不加入外源的NADH，作為參比。所有溶液混勻，在25 ℃保溫30 min。

(3)保溫結(jié)束后立即加入1 mL 1% 磺胺溶液終止酶反應(yīng)，再加1 mL 0.2%萘基乙烯胺溶液，黑暗中顯色30 min 后(此次保溫時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定時(shí)的保溫時(shí)間需嚴(yán)格一致)，過濾，以參比管為空白參比，測(cè)定酶反應(yīng)組濾色在540 nm 的光密度。

1.5 不同N 源對(duì)硝酸還原酶誘導(dǎo)活性的影響

對(duì)番茄、辣椒和小麥實(shí)施不同的N 素培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)液在1 ×Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的基礎(chǔ)上略作修改，其中包括以(NH4)2SO4作為N 源和以KNO3作為N 源2 種培養(yǎng)液，分別記作-N 和-N，每種植物在每種培養(yǎng)液下培養(yǎng)6 盆，其中3 盆用于硝酸還原酶的誘導(dǎo)，另外3 盆作為對(duì)照，分別作好標(biāo)記，每種植物共培養(yǎng)12 盆，3 種植物共36 盆。3 d 后，實(shí)施1.3 節(jié)和1.4 節(jié)內(nèi)容。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將所得數(shù)據(jù)輸入Excel，借助SPSS 中的方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物材料NR 活性的差異

對(duì)缺N 營(yíng)養(yǎng)液中的植物材料進(jìn)行硝酸還原酶的誘導(dǎo)，結(jié)果表明各材料間NR 活性有顯著差異。其中，除番茄外，其余6 中植物均誘導(dǎo)測(cè)得NR 活性;但是在這6 種測(cè)得NR 活性的植物材料中，僅有辣椒在未誘導(dǎo)組未檢測(cè)到活性，而其他5 種植物中均檢測(cè)到很高的NR 活性;活性大小方面6 種植物都很好，對(duì)于本科實(shí)驗(yàn)來講都還比較合適(見表1)。

表1 不同植物硝酸還原酶活性的差異

2.2 不同N 源對(duì)硝酸還原酶誘導(dǎo)活性的影響

選擇有代表性且在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中經(jīng)常使用的小麥、辣椒和番茄為實(shí)驗(yàn)材料，研究不同N 源對(duì)NR 活性的影響。結(jié)果表明:2 種N 源對(duì)3 種植物KNO3誘導(dǎo)敏感性的影響具有物種特異性。對(duì)于番茄，在NH+4-N培養(yǎng)條件下，添加KNO3誘導(dǎo)能檢測(cè)到微弱的NR 活性，其他3種培養(yǎng)條件均未檢測(cè)到NR活性;對(duì)于辣椒來講，4 種處理均檢測(cè)到NR 活性，但在培養(yǎng)條件下，添加KNO3誘導(dǎo)對(duì)NR 活性無顯著提高，而-N 培養(yǎng)條件下，KNO3誘導(dǎo)能顯著提高NR 活性;對(duì)于小麥來講，4 種處理均檢測(cè)到NR 活性，培養(yǎng)-N 條件下，對(duì)照組檢測(cè)到很低的NR 活性，添加KNO3誘 導(dǎo) 能 顯 著 提 高 NR 活 性(達(dá) 8. 68 μg/(g·h));-N 培養(yǎng)條件下，未誘導(dǎo)組和添加KNO3誘導(dǎo)處理所得NR 活性接近，表明KNO3添加對(duì)在-N 培養(yǎng)的小麥NR 不能起到誘導(dǎo)作用。

表2 不同培養(yǎng)條件對(duì)番茄、辣椒和小麥硝酸還原酶活性誘導(dǎo)的差異

3 討 論

本研究結(jié)果證明:在誘導(dǎo)環(huán)境相對(duì)適宜并相同的情況下，物種的差異(即遺傳因素)對(duì)NR 誘導(dǎo)活性且決定性作用。本研究中辣椒(Capsicum annuum)在無KNO3的添加的對(duì)照組中未檢測(cè)到NR 活性，而在KNO3的添加的誘導(dǎo)組中檢測(cè)到很好的活性，從某種程度上能證明NO－3的誘導(dǎo)作用;此外，小麥(Triticum aestivum)，大白菜(Beassica pekinensis)，蘿卜(Raphanus sativus)，玉米(Zea mays)，油菜(Brassica campestris)在無KNO3添加的對(duì)照組中，仍能檢測(cè)出很高的NR 活性，表明NR 誘導(dǎo)中的作用不在于(至少不完全在于)通過影響KNO3的吸收，即已經(jīng)存在NR 活性的植物，在一定的環(huán)境條件下，即使無KNO3的添加也能維持其活性［14］。但本研究中多數(shù)物種在添加KNO3的誘導(dǎo)組，NR 活性顯著提高(見表1)。隨著科學(xué)研究的進(jìn)行，NR 作為誘導(dǎo)酶的定義(植物本身不含有，只有外加NO－

3 才能誘導(dǎo)生成)也需要通過正式的教科書進(jìn)行修訂。其實(shí)，林建明等［14］就對(duì)NR 的誘導(dǎo)機(jī)理提出過有兩種情況:①酶蛋白的重新合成(植物本身不含有，只有外加NO－3，才能誘導(dǎo)生成);②酶前體的活化(說明不一定需要外加NO－3，才能誘導(dǎo)生成)。另外，番茄在對(duì)照組和誘導(dǎo)組均未檢測(cè)到NR 活性，在其他研究中也有類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如陶懿偉等［6］實(shí)驗(yàn)中紫藤等6 種植物未檢測(cè)到NR 活性，隨著科學(xué)的進(jìn)步，相關(guān)機(jī)制會(huì)逐步清晰。

本研究結(jié)果證明:不同形態(tài)的氮素對(duì)植物體內(nèi)的NR 活性有不同的影響，可能表現(xiàn)為促進(jìn)、抑制或者無顯著影響，在相同的培養(yǎng)環(huán)境中，主要體現(xiàn)在物種水平上的差異。在本研究中有如下幾種情況:

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