田娟，陳彪，呂浩，吳志兵

(貴州大學(xué) 精細化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025)

陽離子廣泛存在于自然界中，一些陽離子在許多生理過程中起到了重要的作用，如鐵離子可作為血紅蛋白中氧氣的載體，并在許多酶反應(yīng)中起輔助作用，還有一些陽離子(如汞、鉻等)在很低的濃度時就對生物體具有極強的毒性，并是重要的環(huán)境污染物［1-4］。因此，對陽離子的識別和檢測在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中占有重要地位。傳統(tǒng)的陽離子檢測方法主要有高效液相層析法、質(zhì)譜分析法、原子吸收光譜法、電感耦合等離子原子發(fā)射光譜法等［5-8］，但都需要使用昂貴的儀器，并要準備大量的樣品。近年來，由于熒光分子探針具有響應(yīng)快速、選擇性高、靈敏度高等優(yōu)點，因此成為檢測陽離子最方便快捷的方法［9-11］。熒光分子探針的設(shè)計原理主要包括以下幾類:光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)［12-13］、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)［14-15］、單體-激基締合物［16-17］、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)［18-20］。其中，熒光共振能量轉(zhuǎn)移由于其高的靈敏度及較大的斯托克斯位移而備受人們關(guān)注。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指當一對合適的物質(zhì)構(gòu)成一個能量供體和能量受體，當兩者相隔距離在1.0～10.0 nm，并且供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜能有效地重疊，以供體的激發(fā)光激發(fā)，供體分子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)之后，由于偶極-偶極相互作用，供體分子激發(fā)態(tài)能量就有可能以非輻射的形式有效地被傳遞至受體分子，而后受體分子通過發(fā)射出光子而弛豫，這就是熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程［21］。常見的熒光團主要有羅丹明、香豆素、熒光素、蒽、芘、萘酰亞胺等，其中羅丹明具有高的消光系數(shù)，較高的熒光量子產(chǎn)率，螺內(nèi)酰胺開環(huán)會產(chǎn)生熒光大幅增強的off-on 過程，是一類非常好的熒光染料及FRET 受體;而1，8-萘酰亞胺具有好的穩(wěn)定性、高熒光量子產(chǎn)率、在4 位和亞胺上易進行結(jié)構(gòu)修飾等優(yōu)點，是一類重要的熒光團和FRET 供體;且1，8-萘酰亞胺的發(fā)射光譜能與羅丹明的吸收光譜有效的重疊，故萘酰亞胺-羅丹明成為受人矚目的能量供體-受體對［22-25］。

本文根據(jù)與不同陽離子的作用進行分類，綜述了近年來國內(nèi)外基于1，8-萘酰亞胺-羅丹明的FRET機理陽離子探針的研究。

1 陽離子探針研究進展

1.1 汞離子探針

Hg2+具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性，這使其成為目前全球最引人關(guān)注的環(huán)境污染物之一［26］。正是因為Hg2+存在高毒性，因此開發(fā)研制成本低、響應(yīng)快、易實現(xiàn)、能應(yīng)用于自然環(huán)境和生物體系的新型Hg2+檢測手段顯得尤為重要。

Guo 等［27］以硫脲為連接基團，合成FRET 機理的Hg2+比率熒光分子探針(1)。在探針的甲醇緩沖溶液(10 mmol/L Tris-HCl，2 ∶1，V/V，pH 7.0)中加入Hg2+后，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移使羅丹明開環(huán)，形成1，3，4-噁二唑環(huán)(見圖1)，熒光輻射從540 nm紅移到585 nm，熒光輻射增強65 倍，同時溶液顏色由無色變?yōu)榧t色，能量轉(zhuǎn)移效率達到86.3%。熒光滴定實驗證明，熒光輻射強度和Hg2+濃度在2 ～10 μmol/L、0.3 ～1 μmol/L 和0.03 ～0.08 μmol/L范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，具有極高的靈敏度。該探針可在pH 5.7 ～11.0 范圍內(nèi)實現(xiàn)Hg2+檢測，除了Ag+和Cu2+對Hg2+檢測具有微弱的影響外，其他金屬離子均無干擾。

圖1 探針(1)與Hg2+的反應(yīng)機理圖Fig.1 The response mechanism of (1)+ Hg2+

Mahato 等［28］設(shè)計了一個可檢測Hg2+和Cr3+的雙探針分子(2)。在探針的乙腈緩沖溶液(1 mmol/L HEPES，1 ∶1，V/V，pH 7.2)中加入Hg2+或Cr3+，發(fā)生FRET 過程(見圖2)，561 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰，583 nm 處出現(xiàn)強的羅丹明的發(fā)射峰，溶液顏色由無色變?yōu)榉奂t色，熒光顏色由黃色變?yōu)榧t色。有趣的是在Hg2+的粉紅色溶液中加入過量的KI，生成HgI2，溶液顏色消失，繼續(xù)在此混合溶液中加入Cr3+，溶液又變回粉紅色，因此在有過量KI 存在時，探針(2)對Cr3+具有較好的選擇性，其他金屬離子不產(chǎn)生干擾。Job 曲線表明，探針與Hg2+或Cr3+以1 ∶1 結(jié)合。熒光滴定實驗證明，探針與Hg2+或Cr3+的結(jié)合常數(shù)分別為(1. 09 ±0. 02)×105L/mol 和(1.12 ±0.01)×105L/mol，熒光輻射強度比值F583/F533分別增強25.1 和22.75 倍。探針可用于A431細胞中Hg2+和Cr3+的顯影成像研究。

圖2 探針(2)與Hg2+絡(luò)合結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 The structure of (2)+ Hg2+ complex

Luxami 等［29］報道了一個基于FRET 機理的可逆的熒光分子探針(3)。在空白探針溶液中加入汞離子，可使羅丹明開環(huán)產(chǎn)生熒光，585 nm 處的熒光輻射增強了140 倍，熒光顏色由藍色變?yōu)榧t色，而再在其中加入KI 或生物硫醇(如半胱氨酸)時，又會發(fā)生可逆的FRET 現(xiàn)象，使羅丹明閉環(huán)，萘酰亞胺恢復(fù)熒光(見圖3)。選擇性實驗表明，除銅離子可誘導(dǎo)探針(3)有微弱的熒光增強外，其他金屬離子無干擾。此外，探針(3)可以選擇性的檢測小麥樣品中的生物硫醇。

圖3 探針(3)與Hg2+絡(luò)合結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 The structure of (3)+ Hg2+ complex

1.2 鋁離子探針

Li 等［30］設(shè)計了可用于Hela 細胞內(nèi)Al3+分布顯影成像研究的探針(4)。在pH 6.0 ～8.0，加入Al3+后，發(fā)生FRET 過程，羅丹明開環(huán)(見圖4)，該化合物在580 nm 處熒光增強，熒光強度比值F580/F530增強11 倍從0.42 增大至4.88，溶液由無色變?yōu)榉奂t色。Al3+在0. 1 ～50 μmol/L 的 濃 度 范 圍 內(nèi)，10 μmol/L的探針(4)溶液對Al3+的檢出限為0.1 μmol/L。探針與Al3+形成1 ∶1 絡(luò)合，絡(luò)合常數(shù)為7.5 ×104L/mol。選擇性實驗表明，除了Mn2+有極小的影響外，其他金屬離子無干擾。

圖4 探針(4)與Al3+絡(luò)合結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 The structure of (4)+ Al3+ complex

1.3 鐵離子探針

近年來，F(xiàn)e3+熒光探針研發(fā)突飛猛進，在設(shè)計探針分子的過程中，1，8-萘酰亞胺和羅丹明熒光團受到了特別的關(guān)注。Thennarasu 等［31］基于FRET 機理，設(shè)計了對Fe3+具有高度選擇性的熒光分子探針(5)。當向該探針的乙腈緩沖溶液(V ∶V =1 ∶1，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 7.4)中加入Fe3+，誘導(dǎo)能量從萘酰亞胺轉(zhuǎn)移到羅丹明，使羅丹明開環(huán)(見圖5)，最大吸收波長從415 nm 紅移到560 nm，吸光度增強了458 倍，熒光輻射從532 nm 紅移到580 nm，溶液由淺黃色變?yōu)榉奂t色。Job 曲線表明，探針與Fe3+為1 ∶1 絡(luò)合。探針(1)的熒光輻射強度與鐵離子的濃度在0.05 ～10 μmol/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，F(xiàn)e3+的最低檢出限達到3 ×10－9，并且探針可用于NIT 3T3 細胞內(nèi)Fe3+的顯影檢測。

圖5 探針(5)與Fe3+絡(luò)合結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5 The structure of (5)+ Fe3+ complex

1.4 錫離子探針

Yi 等［32］首次報道了一個可用于檢測活細胞內(nèi)Sn4+的熒光分子探針(6)(見圖6)。向探針溶液中分別加入Sn4+、Cu2+和Cr3+時，1 min 內(nèi)溶液由淺黃色變?yōu)榧t色，在555 nm 處出現(xiàn)最大吸收峰，熒光輻射從523 nm 紅移到580 nm，輻射光從淺黃色變?yōu)殚冱S色，而其他金屬離子基本不產(chǎn)生干擾。然而把EDTA 加入(6)+ M(M = Sn4+、Cu2+和Cr3+)溶液中，30 min 內(nèi)絡(luò)合體(6)+Sn4+的橘黃色熒光部分褪色，恢復(fù)到原始的淺黃色，而絡(luò)合體(6)+Cu2+和(6)+Cr3+則沒有變化，因此該探針可用于實時監(jiān)控細胞和生物體內(nèi)的Sn4+。運用紫外可見吸收法，該探針對Sn4+的檢出限為11 μmol/L。

圖6 探針(6)與Sn4+絡(luò)合結(jié)構(gòu)示意圖Fig.6 The structure of (6)+ Sn4+ complex

1.5 鉻離子探針

Li 等［33］基于FRET 機理設(shè)計了一個能與Cr3+進行多位點結(jié)合的熒光分子探針(7)。探針溶液(C2H5OH/H2O，V/V =2 ∶1)中加入Cr3+后，能量從萘酰亞胺轉(zhuǎn)移到羅丹明，誘導(dǎo)羅丹明開環(huán)(見圖7)，在568 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰，并伴隨著溶液顏色由淺黃色變?yōu)殚偌t色。熒光輻射強度比值F592/F544增強7.6 倍從0.77 增大至5.63，探針與Cr3+形成1∶1 絡(luò)合物，絡(luò)合常數(shù)為9.4 ×103L/mol。該探針對Cr3+體現(xiàn)出很好的選擇性，除Mn2+、Ag+和Al3+能誘導(dǎo)探針產(chǎn)生輕微的熒光猝滅或增強外，其他金屬離子均無干擾，可用于Hela 細胞中Cr3+的顯影成像研究。

圖7 探針(7)與Cr3+絡(luò)合結(jié)構(gòu)示意圖Fig.7 The structure of (7)+ Cr3+ complex

1.6 氫離子探針

圖8 探針(8)與H +絡(luò)合結(jié)構(gòu)示意圖Fig.8 The structure of (8)+ H +complex

Bojinov 等［34］以4-(N-甲基哌嗪基)-1，8-萘酰亞胺和羅丹明6G 為能量供受體對，設(shè)計合成了一個基于FRET 機理的pH 探針(8)。當pH 為8.2 時，由于哌嗪上的N-氨基對1，8-萘酰亞胺的PET 效應(yīng)，在水-DMF(4 ∶1，V/V)溶液中以390 nm 為激發(fā)波長激發(fā)1，8-萘酰亞胺，探針只在514 nm 處出現(xiàn)1，8-萘酰亞胺的弱的輻射峰，隨著溶液的酸性增強，當pH為2.5 時，PET 效應(yīng)受到抑制，羅丹明開環(huán)(見圖8)，在522 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰，并在562 nm 處出現(xiàn)強的輻射峰，熒光增強43 倍，能量傳遞效率達到97%。

Bojinov 等［35］以羅丹明6G 為核心，在其周邊引入聚酰胺-胺型樹枝狀結(jié)構(gòu)，合成了2 個pH 探針(9)和(10)。當pH ＞5 時，羅丹明處于閉環(huán)狀態(tài)，體系為無色，1，8-萘酰亞胺由于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，在380 ～530 nm 有吸收。當pH 2 ～5 時，能量從1，8-萘酰亞胺轉(zhuǎn)移到羅丹明，發(fā)生FRET 過程，使羅丹明開環(huán)，在534 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰，因為探針(10)比探針(9)多2 個能量供體，故534 nm 處的吸光度比探針(9)強2 倍，且在560 nm 處羅丹明的輻射區(qū)內(nèi)，探針(10)和探針(9)的輻射強度各增強了10 倍。

圖9 不同pH 時探針(11)與H +絡(luò)合結(jié)構(gòu)示意圖Fig.9 The structure of (11)+ H +complex at different pH

同年，該課題組基于同樣的結(jié)構(gòu)，將1，8-萘酰 亞胺4 位上的烷基胺換成哌嗪基［36］，合成了一個含捕光天線的pH 探針(11)。在堿性溶液中，探針哌嗪三級胺上的電子向1，8-萘酰亞胺轉(zhuǎn)移，發(fā)生PET效應(yīng)，使體系熒光猝滅。當溶液pH 2 ～6 時，在510 nm 處激發(fā)1，8-萘酰亞胺，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使羅丹明開環(huán)，探針在560 nm 處出現(xiàn)強的輻射峰(見圖9)，且能量轉(zhuǎn)移效率為91%。選擇性實驗表明，在羅丹明輻射區(qū)內(nèi)過渡金屬離子基本無干擾。

Fan 等［37］基于FRET 機理以同樣的能量供受體對合成了比率型pH 探針(12)。當pH 為2.00 ～7.20 時，隨著酸性的增強，能量從萘酰亞胺轉(zhuǎn)移到羅丹明，使羅丹明開環(huán)，538 nm 處萘酰亞胺的輻射峰逐漸減弱，580 nm 處出現(xiàn)新峰，強度逐漸增大，該峰為羅丹明的特征峰，能量傳遞效率為72%。選擇性實驗表明，不同的金屬離子和氨基酸不干擾H+的檢測，該探針對H+具有極高的選擇性，可與MCF-7 細胞內(nèi)的溶酶體結(jié)合，用于pH 顯像。

2 結(jié)束語

基于1，8-萘酰亞胺-羅丹明的FRET 機理陽離子探針具有裸眼識別、響應(yīng)快、選擇性高等優(yōu)點，通過不同的橋接基團引入多樣化的識別基團，并在1，8-萘酰亞胺的四位或亞胺上引入不同的取代基，可實現(xiàn)對陽離子的選擇性識別和檢測。盡管部分性質(zhì)優(yōu)秀的探針已經(jīng)成功應(yīng)用于活細胞的顯影成像，但是進一步優(yōu)化已有探針的性能，推進其在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的實際應(yīng)用，開發(fā)新型的具有選擇性好、對生物體副作用小和對環(huán)境友好的熒光分子探針仍是該項研究的重點和難點。

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