楊珍珍，徐峰，陳紅云，陳曉芳

(臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000)

1，3，5-三嗪類衍生物因具有廣泛的生物活性(如抗菌活性［1-2］、抗錐蟲活性、抗炎活性［3］、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒活性［4］、細(xì)胞毒活性［5］和血管新生抑制活性［6］等)而備受關(guān)注。近年來(lái)，特別是其抗癌活性引起了學(xué)者們的廣泛研究［7-9］。如Moon 等［7］發(fā)現(xiàn)化合物2-環(huán)己基氨基-4-(4-甲氧芐基氨基)-6-(3，4-二甲氧基芐基氨基)-1，3，5-三嗪可作為異種微管解聚的化學(xué)實(shí)體，對(duì)U937 細(xì)胞具有強(qiáng)效的生長(zhǎng)抑制作用(GI50=1 μmol/L)。Zheng 等［8］發(fā)現(xiàn)化合物2-苯基氨基-4-(4-甲氧苯基氨基)-6-嗎啉基-1，3，5-三嗪對(duì)結(jié)腸直腸癌(CRC)細(xì)胞株HCT-116 具有顯著的抑制活性(IC50=0.76 μmol/L)，體內(nèi)抗腫瘤及代謝動(dòng)力學(xué)研究表明，該化合物極有希望成為進(jìn)一步開發(fā)抗腫瘤藥物新的化學(xué)實(shí)體。Baindur 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，化合物2-羥基-4，6-二胺-1，3，5-三嗪是一類新的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGF-R2)酪絡(luò)氨酸激酶的強(qiáng)效抑制劑，在體外酶抑制濃度達(dá)到納摩爾級(jí)(IC50=18 nmol/L)。因此，1，3，5-三嗪骨架類的衍生物在抗腫瘤活性中具有客觀的應(yīng)用前景，但此方面研究國(guó)外較熱，國(guó)內(nèi)才剛剛起步。

1，2，4，5-四嗪是一類重要的富含氮元素的雜環(huán)化合物，具有多種生理活性，如抗病毒［10］、抗菌［11］、抗炎［12］等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一些含有氨基1，2，4，5-四嗪類化合物具有潛在的抗腫瘤活性［13-15］，因而此類化合物的研究日益受到重視。

本課題組在前階段已經(jīng)合成了一系列6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-3-肼基-1，2，4，5-四嗪類化合物［16-17］，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)骨架拼接原理，我們期望將1，2，4，5-四嗪環(huán)與1，3，5-三嗪拼接后，形成一種結(jié)構(gòu)新穎的含三嗪環(huán)的四嗪類化合物，并對(duì)其進(jìn)行體外抗腫瘤活性的檢測(cè)。以3，6-二(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪(1)為起始原料，將其制備成肼基均四嗪(2)，再與三聚氯氰和芳胺反應(yīng)，得到6-［2-(1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基］-1，3，5-三嗪類化合物(3)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

三聚氯氰、碳酸鉀、二氧六環(huán)、乙酸乙酯、無(wú)水硫酸鎂均為分析純;肼基四嗪(1)根據(jù)文獻(xiàn)［16］合成。

XRC-1 熔點(diǎn)儀;Nicolex FTIR-170 紅外光譜儀;Brucker AC400 (400 MHz)核磁共振儀(以TMS 為內(nèi)標(biāo));HP5989A 型質(zhì)譜儀;Thermo Finnigan Flash EA1112 元素分析測(cè)定儀。

1.2 合成

工藝路線如下:

1.2.1 6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-3-肼基-1，2，4，5-四嗪(2)的合成 根據(jù)文獻(xiàn)工藝［16］，總收率為54.7%，熔點(diǎn)135 ～137 ℃(文獻(xiàn)值［16］135 ～137 ℃)。

1.2.2 6-(2-(6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基)-1，3，5-三嗪-2-胺類化合物的合成(3) 將三聚氯氰(0.23 g，1.25 mmol)、碳酸鉀(0.51 g，3.7 mmol)加入二氧六環(huán)30 mL 中，攪拌，降溫至－5 ℃，開始緩慢滴加混合溶液［將6-(3，5-二 甲 基-1H-吡 唑-1-基)-3-肼 基-1，2，4，5-四 嗪(0.26 g，1.25 mmol)溶于二氧六環(huán)20 mL 的混合溶液］，滴加過(guò)程中控制反應(yīng)溫度－5 ～0 ℃。滴加完畢后，控制溫度在2 ～5 ℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入相應(yīng)的胺2.5 mmol，加熱升溫至100 ℃，回流反應(yīng)3 ～10 h。反應(yīng)結(jié)束后，開始冷卻，抽濾，除去體系中的固體物質(zhì)，濾液減壓蒸餾除溶劑二氧六環(huán)。加入乙酸乙酯20 mL，并用飽和氯化鈉水溶液(3 ×30 mL)洗滌，收集有機(jī)層，加入無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行干燥，抽濾，減壓蒸除溶劑，得到粗品。粗品經(jīng)過(guò)層析柱提純，用正己烷∶乙酸乙酯=1∶1 的混合溶液進(jìn)行洗脫，得到化合物(3)。

6-(2-(6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基)-N2，N4-二(2-甲氧基苯基)-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(3a):黃色固體，產(chǎn)率91. 0%，m.p. 173 ～175 ℃。IR(KBr)/cm－1:3 403，3 362，2 932，1 574，1 512，1 457，1 432，1 248，1 076，1 026，969，745。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.53 (s，2H，Ar)，6.83 ～6.99(m，6H，Ar)，6.01［s，1H，C(CH3)CH—］，3. 04 (s，6H，OCH3)，2. 51 (s，3H，N—C(CH3)CH)，2. 36 (s，3H， N C—CH3)。MS(EI):m/z(%):528(M+，20)，378(15)，347(75)，332(10)，307(30)，275(10)，231(100)，216(10)，201(8)，174(8)，159(10)。理論值C24H25-N13O2:C54.64，H4.78，N34.52;實(shí)測(cè)值C54.60，H 4.86，N34.66。

6-(2-(6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基)-N2，N4-二間甲苯基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(3b):橘紅色固體，產(chǎn)率82.4%，m.p. 124～126 ℃。IR(KBr)/cm－1:3 384，2 923，1 578，1 515，1 488，1 416，1 384，1 079，972，807。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7.10 ～7.36(m，4H，Ar)，6.98(t，2H，J =7.6 Hz，Ar)，6.81 (d，2H，J =7.6 Hz，Ar)，5. 95 ［s，1H，—C(CH3)CH—］，2. 35 ［s，3H，N—C(CH3］CH］，2. 28 (s，3H， N C—CH3)，2. 12 (s，6H，m-ph-CH3)。MS (EI):m/z(%):495(M+，18)，396(5)，346(53)，305(20)，248(15)，215(100)，158(15)，132(13)。理論值C24H25N13:C58.17，H5.09，N36.75;實(shí)測(cè)值C58.22，H5.15，N36.59。

6-(2-(6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基)-N2，N4-(4-氟-3-氯苯基)-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(3c):橘紅色固體，產(chǎn)率77.5%，m. p.135 ～137 ℃。IR(KBr)/cm－1:3 286，2 960，1 581，1 497，1 405，1 263，1 213，1 079，970，870，807。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ:7.41(d，J =7.6 Hz，2H，Ar)，7.11 (d，J =7. 6 Hz，2H，Ar)，6. 88 (m，2H，Ar)，6.01［s，1H，—C(CH3)CH—］，2.41［s，3H，N—C(CH3)CH ］，2. 23 (s，3H， N C —CH3)。MS(EI):m/z(%):572(M+，20)，422(60)，382(35)，324(15)，253(100)，238(10)，196(20)，170(18)。理論值C22H17Cl2F2N13:C46.17，H2.99，N31.81;實(shí)測(cè)值C46.30，H3.11，N31.90。

6-(2-(6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基)-N2，N4-二鄰氯苯基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(3d):橘紅色固體，產(chǎn)率77.7%，m. p.202～204 ℃。IR(KBr)/cm－1:3 245，2 957，1 573，1 498，1 437，1 412，1 384，1 303，1 080，957，807。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:8. 31 (d，2H，J =8.4 Hz，Ar)，7.34 ～7.37 (m，4H，Ar)，6.98 (t，2H，J=8.4 Hz，Ar)，6.01 ［s，1H，—C(CH3)CH—］，2.44 ［s，3H，N—C(CH3)CH］，2. 28(s，3H，NC—CH3)。MS(EI):m/z(%):535(M+，15)，421(25)，386(43)，351(100)，311(25)，288(17)，275(25)，235(87)，178(33)，158(22)。理論值C22H19-Cl2N13:C49. 26，H3. 57，N33. 95;實(shí)測(cè)值C49. 44，H3.60，N33.87。

6-(2-(6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基)-N2，N4-二芐基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(3e):橘紅色固體，收率為92.1%，m.p. 224 ～226 ℃。IR(KBr)/cm－1:3 251，3 117，1 633，1 552，1 493，1 407，1 350，1 295，1 078，983，799。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ:7. 23 ～7. 30(m，10H，Ar)，6.08［s，1H，—C (CH3)CH—］，4. 55 (s，4H，PhCH2)，2.50［s，3H，N—C(CH3)CH］，2.28(s，3H， N C—CH3)。MS (EI):m/z(%):495(M+，18)，325(90)，314(3)，234(15)，220(8)，198(3)，185(4)，131(25)，106(100)，91(100)。理論值C24-H25N13:C58. 17，H5. 09，N36. 75;實(shí)測(cè)值C58. 22，H5.15，N36.59。

N2，N4-二芐基-6-(2-(6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基)-N2，N4-二甲基-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(3f):橘紅色固體，產(chǎn)率62.7%，m.p.116 ～118 ℃。IR(KBr)/cm－1:3 392，3 027，2 924，1 574，1 513，1 452，1 398，1 354，1 246，1 076，969，866，807。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ:6.98 ～7. 33 (m，10H，Ar)，6. 11 ［s，1H，—C (CH3)CH —］，4.73 (s，4H，2CH2)，2.96 ［s，6H，2—N(CH3)2］，2.52［s，3H，N—C(CH3)CH］，2.23(s，3H， N C —CH3)。MS (EI):m/z(%):523(M+，30)，374(85)，359(55)，333(17)，319(15)，303(13)，283(25)，214(14)，145(15)，120(57)，91(100)。理論值C26H29N13:C59.64，H5.58，N34.78;實(shí)測(cè)值C59.72，H5.54，N34.82。

N2，N2，N4，N4-四芐基-6-(2-(6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基)-1，3，5-三嗪-2，4-二胺(3g):紅色固體，產(chǎn)率73.1%，m.p.169～173 ℃。IR(KBr)/cm－1:3 361，3 189，3 026，2 924，1 578，1 530，1 495，1 363，1 253，1 079，970，697。1H NMR (CDCl3，400 MHz)δ:7. 00 ～7. 36(m，20H，Ar)，6. 13［s，1H，—C(CH3)CH—］;4.68(s，8H，phenyl—CH2)，2. 50 ［s，3H，—N—C(CH3)CH］，2. 40(s，3H， N C—CH3)。MS(EI):m/z(%):676(M+，30)，498(30)，435(100)，395(45)，303(25)，131(15)，106(13)，91(100)。理論值C38H37N13:C67.54，H5.52，N26.94;實(shí)測(cè)值C67.44，H5.50，N27.10。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物合成探討

在合成目標(biāo)化合物(3)的過(guò)程中，首先將化合物(2)與三聚氯氰低溫下反應(yīng)，防止多取代產(chǎn)物的生成。反應(yīng)完全后，再加入芳胺，回流反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物(3)。對(duì)反應(yīng)過(guò)程中催化劑的使用進(jìn)行初步探索，我們以合成(3a)為候選實(shí)驗(yàn)，其他條件不變的情況下，分別采用氫氧化鈉、碳酸鉀、三乙胺和吡啶作為催化劑進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)氫氧化鈉作為催化劑，對(duì)四嗪環(huán)具有較大的破壞作用，使得目標(biāo)產(chǎn)物(3)的產(chǎn)率很低(25%)，而三乙胺和吡啶作為催化劑，發(fā)現(xiàn)其能與原料三聚氯氰低溫下就能快速發(fā)生反應(yīng)，因而選擇碳酸鉀作為最終的催化劑。

2.2 目標(biāo)化合物抗腫瘤活性的研究

將合成的化合物(3)進(jìn)行體外抗腫瘤活性檢測(cè)。測(cè)試方法采用四氮唑鹽還原法(MTT 法)，選用體外人絨毛膜癌細(xì)胞株Bewo、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa、人肺癌細(xì)胞株A549、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人白血病細(xì)胞株HL-60 的測(cè)試，作用時(shí)間為72 h，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 化合物(3)體外抗癌測(cè)試結(jié)果(IC50，μmol/L)Table 1 Antitumor measurement result of compounds 3

由表1 可知，順鉑對(duì)Bewo、Ishikawa、A549、MCF-7、Hela 的細(xì)胞有很好的抑制作用，其IC50分別為52.02，29.93，46.06，21.60，3.27 μmol/L。而相對(duì)于順鉑對(duì)上述腫瘤細(xì)胞的抑制作用，本發(fā)明的大部分化合物具有一定的腫瘤細(xì)胞抑制作用，其中部分化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制作用，如(3b)對(duì)Ishikawa 的抑制作用(17.27 μmol/L)強(qiáng)于順鉑(29.93 μmol/L);(3d)和(3f)對(duì)A549 的抑制作用分 別 為 IC50為7. 66，20. 80 μmol/L，比 順 鉑(46.06 μmol/L)還要強(qiáng)。

3 結(jié)論

(1)本文以3，6-二(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪為原料，先合成3-肼基-1，2，4，5-四嗪(2)，再與三聚氯氰和芳胺反應(yīng)，得到6-［2-(1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基］-1，3，5-三嗪類化合物(3)，反應(yīng)結(jié)果顯示，當(dāng)參與反應(yīng)的胺是脂肪胺時(shí)，得到的是4-氯-6-［2-(1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基］-1，3，5-三嗪-2-胺類化合物;當(dāng)參與反應(yīng)的胺是芳香胺時(shí)，得到的是6-［2-(1，2，4，5-四嗪-3-基)肼基］-1，3，5-三嗪-2，4-二胺類化合物。

(2)對(duì)合成的化合物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞株人白血病細(xì)胞株HL-60、人肺癌A549、人乳腺癌MCF-7、人子宮頸癌細(xì)胞株Hela 體外抗腫瘤活性的測(cè)試，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物對(duì)上述腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制活性，其中化合物(3b)、(3d)和(3f)具有優(yōu)于順鉑的抗腫瘤活性，值得進(jìn)一步研究。

［1］ Srinivas K，Srinivas U，Bhanuprakash K，et al. Synthesis and antibacterial activity of various substituted s-triazines［J］.Eur J Med Chem，2006，41(11):1240-1246.

［2］ Hegde J C，Girisha K S，Adhikari A，et al. Synthesis and antimicrobial activities of a new series of 4-S-［41-amino-51-oxo-61-substituted benzyl-41，51-dihydro-11，21，41-triazin-3-yl］mercapto-acetyl-3-arylsydnones［J］.Eur J Med Chem，2008，43(12):2831-2834.

［3］ Leftheris K，Ahmed G，Chan R，et al.The discovery of orally active triaminotriazine aniline amides as inhibitors of p38 MAP kinase［J］.J Med Chem，2004，47(25):6283-6291.

［4］ Xiong Y Z，Chen F E，Balzarini J，et al. Non-nucleoside HIV-1 reverse transcriptase inhibitors. Part 11:Structural modulations of diaryltriazines with potent anti-HIV activity［J］.Eur J Med Chem，2008，43(6):1230-1236.

［5］ Arya K，Dandia A. Synthesis and cytotoxic activity of trisubstituted-1，3，5-triazines［J］. Bioorg Med Chem Lett，2007，17(12):3298-3304.

［6］ Nozaki S，Maeda M，Tsuda H，et al. Inhibition of breast cancer regrowth and pulmonary metastasis in nude mice by anti-gastriculcer agent，irsogladine［J］. Breast Cancer Res Tr，2004，83(3):195-199.

［7］ Moon H S，Jacobson E M，Khersonsky S M，et al.A novel microtubule destabilizing entity from orthogonal synthesis of triazine library and zebrafish embryo screening［J］. J Am Chem Soc，2002，124(39):11608-11609.

［8］ Zheng M F，Xu C H，Ma J W，et al.Synthesis and antitumor evaluation of a novel series of triaminotriazine derivatives［J］.Bioorg Med Chem，2007，15(4):1815-1827.

［9］ Baindur N，Chadha N，Brandt B M.2-Hydroxy-4，6-diamino-［1，3，5］triazines:A novel class of VEGF-R2 (KDR)tyrosine kinase inhibitors［J］.J Med Chem，2005，48(6):1717-1720.

［10］ Werbel L M，Mcnamara D J. Synthesis and antimalarial effects of N，N-dialkyl-6-(substituted phenyl)-1，2，4，5-tetrazin-3-amines［J］. J Heterocycl Chem，1979，16(5):881-894.

［11］Arthur K G，John H B，Gerald B，et al.Controlling bacterial infections using substituted symmetrical tetrazines:GB，1245443［P］.1971-07-08.

［12］ Lang Jr S A，Johnson B，Cohen L E，et al. Aryl-s-tetrazines with antiinflammatory activity［J］. J Med Chem，1976，19(12):1404-1409.

［13］Rao G W，Hu W X.Synthesis，structure analysis，and antitumor activity of 3，6-disubstituted-1，4-dihydro-1，2，4，5-tetrazine derivatives［J］.Bioorg Med Chem Lett，2006，16(14):3702-3705.

［14］Hu W X，Rao G W，Sun Y Q.Synthesis and antitumor activity of s-tetrazine derivatives ［J］. Bioorg Med Chem Lett，2004，14(5):1177-1181.

［15］Makriyannis A，Deng H F.Novel cannabimimetic ligands:WO，2002058636［P］.2002-08-01.

［16］陳建軍，徐峰，楊珍珍.1-芳基亞甲基-2-(6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基)肼的合成及抗菌活性［J］.化學(xué)通報(bào)，2012，75(3):268-271.

［17］閆啟東，徐俊，徐峰，等.1-［6-(3，5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1，2，4，5-四嗪-3-基］酰肼及其衍生物的合成與表征［J］.合成化學(xué)，2011，19(6):709-713.