段永波，趙豐蘭，宋運賢，盛 瑋，薛建平(淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室，安徽淮北235000)

作為生命科學(xué)的重要組成部分，基因工程與細胞工程、酶工程和蛋白質(zhì)工程在分子、細胞、酶學(xué)、蛋白水平共同組成了現(xiàn)代生物工程。其通過將所需的生物遺傳物質(zhì)——脫氧核糖核酸(DNA)從供體生物分離出來，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進行切割后連接至表達載體，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細胞并整合至其基因組，使得目標(biāo)基因在受體細胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，進而發(fā)揮其功能。自上世紀(jì)70年代誕生以來［1］，基因工程已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)保等各領(lǐng)域，在推動現(xiàn)代生命科學(xué)的發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用。

目前，基因工程已作為生物科學(xué)和生物工程專業(yè)的一門核心專業(yè)基礎(chǔ)課，在綜合性大學(xué)、農(nóng)業(yè)大專院校、師范和醫(yī)科大學(xué)等各類高校陸續(xù)開設(shè)。該課程的整條主線都是基于DNA水平的操作，基本屬于“無實物”教學(xué)，給課程學(xué)習(xí)帶來了很大難度。因此，基因工程實驗就成了非常必要的輔助課，也是引導(dǎo)學(xué)生將理論知識應(yīng)用于實踐，培養(yǎng)科學(xué)分析思維能力和創(chuàng)新能力的一門方法學(xué)課程。因其要求學(xué)生具備生化及分子生物學(xué)基本知識和操作技能，單個試驗中間有時間間隔，實驗周期較長，涉及昂貴儀器和試劑的使用，給課程教學(xué)帶來很大挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的基因工程實驗技術(shù)教程主要集中于基因克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證［2］，所開設(shè)實驗常涉及一整套該課程實驗技術(shù)，包括培養(yǎng)基配制和高壓滅菌等常規(guī)實驗。原來該課程教學(xué)目的主要是驗證基因工程操作原理，在創(chuàng)新研究方面的內(nèi)容不多。此外，驗證性的實驗結(jié)果難以帶給學(xué)生創(chuàng)造性的“成就感”，實驗過程多是填鴨式的被動完成。這會導(dǎo)致學(xué)生完全機械性地“做實驗”，以致教學(xué)效果不佳。為提高教學(xué)效果，培養(yǎng)實踐技巧和科學(xué)思維能力，針對高等院校農(nóng)林專業(yè)特點，筆者將系統(tǒng)工程與模塊化設(shè)計相結(jié)合，應(yīng)用于該課程教學(xué)并取得很好的教學(xué)效果。

1 課程建設(shè)思路與設(shè)計

該課程在淮北師范大學(xué)主要針對師范專業(yè)學(xué)生開設(shè)，多數(shù)學(xué)生在畢業(yè)后將從事高中生物教學(xué)。近年來，基因工程及分子生物學(xué)實驗設(shè)計在高考中占有非常重要的地位。在開設(shè)此門課程之前，學(xué)生已經(jīng)累積了微生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等課程及其相應(yīng)的實驗技術(shù)。因此，該課程建設(shè)旨在保證學(xué)生在完全理解基因工程內(nèi)涵的基礎(chǔ)上，進一步培養(yǎng)學(xué)生的科研態(tài)度和創(chuàng)新思維。

該課程僅保留基因工程實驗課程中“分、切、接、轉(zhuǎn)、篩”的經(jīng)典內(nèi)容［3］，在有限的課時內(nèi)完成了從目的基因克隆到載體構(gòu)建過程，并實現(xiàn)所構(gòu)建載體在植物中表達的整個過程?；趥鹘y(tǒng)實驗課程中所獲結(jié)果直觀性不強的缺點，筆者在教學(xué)中引入了啟動子、報告基因和終止子3個元素，通過從植物基因組DNA中克隆啟動子、相關(guān)質(zhì)粒中擴增報告基因連接至表達載體，并實現(xiàn)其在植物細胞中表達，讓學(xué)生完成從基因水平到蛋白表達水平整個過程，同時檢測報告基因表達，直觀地感受實驗的魅力，提高教學(xué)效果。

整體實驗流程設(shè)計劃分為3個相對獨立的模塊，每個模塊都可獨立考核，其后也能放置較長時間至下一個實驗(圖1)。整個課程中學(xué)生將完成基因表達所需元件中啟動子和基因的功能分析。同時，以水稻或玉米2中植物作為實驗材料克隆啟動子，還提供含β－1，4糖苷酶gus的大腸桿菌供克隆報告基因。讓學(xué)生提前查詢資料熟悉引物設(shè)計的原則及方法，親自設(shè)計PCR引物(包括在引物末端添加酶切位點)，掌握報告基因gus作用機理，并根據(jù)自身興趣選擇實驗材料，進而提高其完成實驗的主動性。

2 教學(xué)方案實施

圖1 整體教學(xué)設(shè)計流程

筆者以基因表達框為出發(fā)點，以報告基因為研究對象，改變了傳統(tǒng)基因工程實驗課程中實驗結(jié)果主要以電泳圖譜的單一形式呈現(xiàn)的缺點，將實驗最終結(jié)果以報告基因在植物細胞中的表達檢測來呈現(xiàn)。同時，將系統(tǒng)工程和模塊化設(shè)計思路引入課程教學(xué)，形成整個課程于一個完整實驗，又將其劃分為3個獨立模塊，既提高了學(xué)生對實驗的興趣，又解決了實驗課時間安排的難題。采用小班教學(xué)模式，分2人一小組，保證師生間充分交流及學(xué)生對實驗的充分理解。

在介紹實驗整體流程時，根據(jù)實驗內(nèi)容創(chuàng)造問題情景，引導(dǎo)學(xué)生實驗前查詢所設(shè)置問題可能出現(xiàn)的原因及解決辦法。比如:研究水稻及玉米等作物基因工程技術(shù)的目的、意義及發(fā)展方向，報告基因gus作用機理，電泳中EB染色原理，基因克隆及載體構(gòu)建過程中的難點，農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化植物細胞的原理等。

整個實驗課程均始終貫穿以學(xué)生為主，教師為導(dǎo)的教學(xué)思想。目前表達載體構(gòu)建中質(zhì)粒DNA提取、酶切、連接等操作都有相應(yīng)的試劑盒，因此將課程重點由原來的克隆驗證轉(zhuǎn)到從目標(biāo)基因克隆直至在真核細胞中的表達上。

在開始各實驗單元模塊前，介紹實驗原理及操作步驟，同時引出相應(yīng)的問題供學(xué)生討論。在目的基因PCR擴增實驗中，引導(dǎo)學(xué)生對其所選植物研究意義進行討論，最后教師總結(jié)，指出采用基因工程技術(shù)改良玉米和水稻等重要農(nóng)作物對保障人類糧食安全的重要意義。同時在PCR和酶切實驗間歇增加了電子克隆知識介紹、引物設(shè)計方法及如何通過酶切位點實現(xiàn)基因工程中的“剪切—拼接”過程，采用多媒體展示現(xiàn)代生物學(xué)知識發(fā)展的日新月異。這樣即可將學(xué)生興趣、理論知識和實踐很好地結(jié)合，使學(xué)生加深對實驗的理解，提高教學(xué)效果。

筆者以表達報告基因gus為目標(biāo)，讓每組同學(xué)都克隆啟動子和目的基因這2個表達框中的重要元件，并在生菜中瞬時表達。提供給學(xué)生由筆者構(gòu)建的含有g(shù)us但無啟動子的載體pCAMBIA1381，以及有CaMV35S啟動子但不含報告基因的載體pCAMBIA1305.1。將所構(gòu)建的啟動子及報告基因功能分析的載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，瞬時轉(zhuǎn)化生菜，會得到2組對照載體及上述所構(gòu)建載體。通過報告基因表達分析會得出這樣的結(jié)果:只有啟動子或報告基因都不能表達，必須要2個元件同時存在才能檢測到外源基因表達。結(jié)合實驗過程中介紹的基因內(nèi)含子及表達框中終止子功能，學(xué)生即可直觀地理解基因表達框中各個元件的作用。

鼓勵學(xué)生以科技論文的形式完成實驗報告，包括題目、作者姓名、摘要、引言、材料與方法、結(jié)果與分析、討論、參考文獻等內(nèi)容，重點注意結(jié)果分析與討論部分，以此加深對實驗的理解。強調(diào)實驗報告是課程考核的重要部分，實驗操作完成不夠理想的學(xué)生也可以在此環(huán)節(jié)獲得好成績。

3 結(jié)語

基因工程實驗課程涉及實驗內(nèi)容多、周期長、實驗結(jié)果感官性不強，給學(xué)生和教師都帶來了很大挑戰(zhàn)。筆者以基因表達框為基礎(chǔ)，引入啟動子和報告基因2個元件，不僅讓學(xué)生同時完成2個元件的克隆及其各自在基因表達中的作用，還避免了外源蛋白檢測所需的蛋白抽提和Western blot等復(fù)雜且不易控制的操作。課程完成后，采用雙向選擇的方式引導(dǎo)學(xué)生參與基因工程技術(shù)方向的畢業(yè)設(shè)計與實踐。很多學(xué)生將該課程所學(xué)知識應(yīng)用到畢業(yè)論文中，也培養(yǎng)了學(xué)生的科學(xué)思維方法。

基因工程技術(shù)更新極快，但每項技術(shù)發(fā)明后生物技術(shù)公司就會在很短時間內(nèi)研制并發(fā)布相應(yīng)操作規(guī)程，因此未來基因工程實驗技術(shù)的主要目標(biāo)應(yīng)該轉(zhuǎn)向培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新創(chuàng)造能力。在今后課程改革中，筆者將嘗試以科研課題為載體，進一步加深基因工程實驗課程與學(xué)生畢業(yè)論文設(shè)計的結(jié)合，拓寬學(xué)生科研思維，以助于其今后從事教學(xué)、科研等工作。

［1］JACKSON D A，SYMONS R H，BERG P.Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of simian virus 40:circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli［J］.PNAS，1972，69(10):2904 －2909.

［2］盛小禹.基因工程實驗技術(shù)教程［M］.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，1999.

［3］J·薩姆布魯克，D·W·拉塞爾.分子克隆實驗指南［M］.黃培堂，譯.北京:科學(xué)出版社，2002.