林 淼 張建剛 王 嚴(yán) 姚文成 趙國琦

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

反芻動(dòng)物飼糧氮的來源主要包括真蛋白氮和非蛋白氮，其中非蛋白氮包括硝態(tài)氮、胺類、氨化物、氨基酸氮和尿素氮等。硝態(tài)氮能夠在一定程度上替代尿素和真蛋白質(zhì)飼料，降低飼養(yǎng)成本。國內(nèi)外研究表明，反芻動(dòng)物飼糧中可以用硝酸鹽)替代尿素和真蛋白質(zhì)飼料作為瘤胃氮來源，同時(shí)減少甲烷的生成，改變瘤胃發(fā)酵模式，提高瘤胃微生物氮合成量［1－7］。由于反芻動(dòng)物復(fù)雜的瘤胃內(nèi)環(huán)境及體外培養(yǎng)法的條件限制，對動(dòng)物瘤胃發(fā)酵特性的影響仍限于模型模擬，且已有的報(bào)道結(jié)果并不一致，因此該模型尚不能準(zhǔn)確代表對瘤胃液pH、氨態(tài)氮(NH3-N)產(chǎn)量、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度、微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量等影響程度的實(shí)際數(shù)據(jù);此外，動(dòng)物采食后，其瘤胃液和亞硝酸鹽()濃度隨時(shí)間的變化趨勢仍有待深入研究。為此，本試驗(yàn)旨在通過對湖羊直接飼喂不同水平的硝酸鉀(KNO3)，采集各時(shí)間點(diǎn)的瘤胃液，研究濃度的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及其對瘤胃發(fā)酵參數(shù)、血液指標(biāo)等的影響，探討對反芻動(dòng)物瘤胃代謝的影響，為生產(chǎn)實(shí)踐中合理有效地添加提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取9頭體況良好、體重相近［(35.0±3.0)kg］、安裝永久性瘤胃瘺管的湖羊，隨機(jī)分為3組，每組3頭，分別飼喂含0(對照組)、0.5%、1.0%KNO3的飼糧。適應(yīng)期 30 d，之后為3 d采樣期。

1.2 試驗(yàn)飼糧及飼養(yǎng)管理

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) %

1.3 樣品的采集與分析

1.3.1 樣品采集及測定指標(biāo)

適應(yīng)期內(nèi)為達(dá)到最終添加濃度，采用逐級遞增的添加方式，每隔5 d升高1個(gè)KNO3的梯度，直至分別保持0.5%、1.0%的添加水平。采樣期內(nèi)分別于晨飼后 0、0.5、1、1.5、2、4、6、8 h 通過真空負(fù)壓裝置，從瘤胃上下左右不同位點(diǎn)采集約30 mL瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾，立即采用pHS－3C型pH計(jì)測定其 pH，之后分裝于10 mL離心管中，－20℃冰箱中保存待測其他指標(biāo)。采樣期每日晨飼后2 h，頸靜脈采血，分裝，一份加入抗凝劑，待測血液高鐵血紅蛋白濃度;另一份靜止30 min，待析出血清時(shí)，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，置于－20℃冰箱保存，待測血清生化指標(biāo)。

1.3.2 指標(biāo)測定方法

1)NH3-N濃度:采用酚－次氯酸鈉比色法［8］。

2)微生物蛋白質(zhì)濃度:對 Hall等［9］的方法改進(jìn)，采用差速離心法，取4 mL瘤胃液放入5 mL的離心管中，離心10 min(500 r/min)，沉淀為原蟲，上清液轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中;將裝有上清液的5 mL離心管再經(jīng)過15 min離心(12 000 r/min)，沉淀為細(xì)菌;然后分別將兩者的沉淀加4 mL 10%三氯乙酸(TCA)，混合均勻，置室溫30 min，沉淀蛋白質(zhì);在沉淀中加入4 mL 5%氫氧化鈉(NaOH)溶解;離心10 min(4 000 r/min)，取上清液;以5%NaOH作空白，用756型紫外分光光度計(jì)測定280和260 nm處的吸光度。

計(jì)算公式:蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)=(1.45A280－0.74A260)×稀釋倍數(shù)。

3)VFA濃度:發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液 1 mL，加 0.2 mL 20%的偏磷酸(含60 mmol/L巴豆酸)，10 000 r/min再次離心15 min，取上清液1μL，以巴豆酸為內(nèi)標(biāo)物，采用日本島津GC－14B氣相色譜儀測定乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度［10］。測定條件:毛細(xì)管柱CP-WAX(柱長30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚 1 μm);載氣為高純 N2(壓力 0.7 MPa，流量30 mL/min);燃?xì)鉃?H2(流量30 mL/min);氣化室溫度200℃，火焰離子化檢測儀(FID)檢測器溫度200℃;柱溫采用程序升溫法，初溫100℃，末溫130℃，升溫速率3℃/min，靈敏度為10，衰減為25。

6)血液指標(biāo):血清生化指標(biāo)由全自動(dòng)生化分析儀測定;血液高鐵血紅蛋白濃度按照Benesch等［12］的方法進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel軟件整理，采用 SPSS 13.0軟件的one-way ANOVA進(jìn)行方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行差異顯著性比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖羊瘤胃液和濃度的動(dòng)態(tài)變化

圖1 湖羊瘤胃液和濃度的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of nitrate and nitrite concentrations in rumen fluid of Hu sheep

圖2 對湖羊瘤胃液p H和NH 3-N濃度的影響Fig.2 Effects of nitrate on pH and NH3-N concentration in rumen fluid of Hu sheep

表2 對湖羊瘤胃液微生物蛋白質(zhì)濃度的影響Table 2 Effects of nitrate on concentration of microbial protein in rumen fluid of Hu sheep mg/mL

表2 對湖羊瘤胃液微生物蛋白質(zhì)濃度的影響Table 2 Effects of nitrate on concentration of microbial protein in rumen fluid of Hu sheep mg/mL

項(xiàng)目Items時(shí)間Time/h硝酸鉀添加水平KNO3supplemental level/%0 0.5 1.0 0細(xì)菌蛋白BCP 0.55±0.10 0.65±0.21 0.69±0.18 0.5 0.59±0.10 0.71±0.38 0.74±0.02 1 0.69±0.16 0.68±0.14 0.83±0.02 1.5 0.66±0.12 1.08±0.21 0.95±0.09 2 0.66±0.09 0.77±0.30 0.96±0.10 4 0.98±0.01 1.09±0.12 1.05±0.02 6 0.74±0.01 0.78±0.25 0.85±0.58 8 0.91±0.03 0.84±0.30 0.92±0.42 0原蟲蛋白PCP 0.65±0.22 0.69±0.14 0.72±0.12 0.5 0.86±0.32 0.92±0.12 0.96±0.30 1 1.00±0.20 1.03±0.44 1.19±0.03 1.5 0.96±0.15b 1.24±0.04a 1.23±0.28a 2 0.71±0.13 1.04±0.28 0.82±0.09 4 0.67±0.10 0.95±0.07 0.71±0.03 6 1.08±0.08b 1.49±0.25a 1.17±0.19b 8 0.64±0.04 1.05±0.32 1.56±0.51

續(xù)表2

表3 對湖羊瘤胃液VFA濃度的影響Table 3 Effects of nitrate on concentrations of volatile fatty acids in rumen fluid of Hu sheep

表3 對湖羊瘤胃液VFA濃度的影響Table 3 Effects of nitrate on concentrations of volatile fatty acids in rumen fluid of Hu sheep

項(xiàng)目Items時(shí)間Time/h硝酸鉀添加水平KNO3supplemental level/%0 0.5 1.0 0 76.98±5.02b 89.05±1.84ab 99.95±10.49總揮發(fā)性脂肪酸TVFA/(mmol/L)a 0.5 81.78±6.40 91.68±6.97 98.83±17.96 1 82.91±3.98 90.67±14.09 107.10±2.78 1.5 90.53±4.35 97.48±6.53 113.19±25.65 2 104.91±1.27 115.89±17.80 119.73±24.32 4 91.76±0.66c 116.59±0.83a 109.88±1.77b 6 96.99±0.52 111.97±13.05 103.65±12.95 8 70.37±3.44b 90.72±1.55a 94.28±3.28 0乙酸Acetate/(mmol/L)a 53.33±4.95b 59.96±9.05ab 79.56±6.62a 0.5 59.38±5.50 70.00±5.55 79.96±17.16 1 60.07±1.09b 69.41±10.03ab 82.44±2.20a 1.5 65.92±2.93 73.09±4.77 89.47±20.08 2 76.55±0.72 86.55±11.59 96.10±23.22 4 64.50±0.45b 86.03±0.29a 87.53±3.94a 6 68.66±0.28 82.78±12.44 79.24±11.53 8 50.49±1.41c 66.99±0.25b 75.74±1.19a 0丙酸Propionate/(mmol/L)14.35±0.88 16.83±4.72 14.78±2.92 0.5 13.68±1.12 13.38±0.40 13.67±0.73 1 14.01±0.65 13.57±2.63 16.99±0.32 1.5 14.78±0.16 15.12±1.42 16.61±4.02 2 16.41±0.45 18.27±3.80 16.81±1.21 4 15.76±0.14 18.51±1.04 16.34±1.53 6 16.45±0.09 17.38±1.40 16.82±0.49 8 11.94±0.59 14.07±0.16 13.23±1.48

續(xù)表3

表4 對湖羊血液指標(biāo)的影響Table 4 Effects of nitrate on blood indices of Hu sheep

表4 對湖羊血液指標(biāo)的影響Table 4 Effects of nitrate on blood indices of Hu sheep

項(xiàng)目Items硝酸鉀添加水平KNO3supplemental level/%0 0.5 1.0總蛋白TP/(g/L)71.53±4.48 68.30±3.32 71.13±2.40白蛋白 ALB/(g/L) 34.10±3.96 33.68±1.75 34.03±2.39球蛋白 GLB/(g/L) 37.43±3.55 34.63±4.64 37.10±0.56葡萄糖 GLU/(mmol/L) 3.99±0.63 3.89±0.56 4.14±0.05尿素氮 UN/(mmol/L) 5.78±0.80 5.80±0.88 5.47±0.33甘油三酯 TG/(mmol/L) 0.35±0.09 0.21±0.10 0.28±0.07總膽固醇 TCH/(mmol/L) 2.10±0.30 1.94±0.36 1.82±0.40高鐵血紅蛋白BM/% ＜0.1 ＜0.1 ＜0.1

3 討論

各組的pH變化在正常范圍內(nèi)(6.55～7.09)，喂后2、6、8 h的1.0%組pH顯著高于對照組，其他時(shí)間點(diǎn)3個(gè)組間無顯著差異。結(jié)果與Guo等［4］類似，但與其他結(jié)果不同。Phuc等［14］研究指出，給每頭山羊每天飼喂 0、2、4、6 g 的 KNO3，對瘤胃液pH仍無顯著影響。代俊芳等［7］通過體外法發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加含不同比例硝態(tài)氮的顆粒料未對瘤胃液pH產(chǎn)生顯著影響。Lin等［2，15］比較不同氮源和適應(yīng)前后的體外瘤胃pH均無顯著差異。與前人研究結(jié)果不同的可能原因是本試驗(yàn)采用活體研究且添加水平與前人略有不同。

從發(fā)酵時(shí)間來看，NH3-N濃度的變化主要是由于飼糧中含氮物質(zhì)不斷降解產(chǎn)生氨，導(dǎo)致NH3-N濃度快速上升;之后瘤胃微生物以氨為原料合成細(xì)菌蛋白，導(dǎo)致NH3-N濃度逐漸下降。Sar等［16］報(bào)道，當(dāng)綿羊飼糧組成為提摩西草∶苜蓿干草∶精料=400∶400∶200時(shí)，按每頭綿羊每 kg代謝體重(BW0.75)添加 1.3 g 硝酸鈉(NaNO3)，也引起了NH3-N濃度的增加。同時(shí)，1.0%組顯著高于對照組，這與Kemp等［17］研究結(jié)果相近。

本試驗(yàn)關(guān)于VFA濃度的結(jié)果與 Guo等［4］研究結(jié)果相近，表明的添加使得瘤胃發(fā)酵模式更傾向于乙酸發(fā)酵，可能是由于還原過程中改變了瘤胃微生物的某些代謝途徑，在一定程度上阻斷了乙酸向丙酸合成的過程［12］;或者是的快速降解使得電子從丁酸形成轉(zhuǎn)移到還原的方向［2］。但也有報(bào)道認(rèn)為可以提高瘤胃液丙酸和丁酸產(chǎn)量，使發(fā)酵模式更傾向于丙酸發(fā)酵［6］。差異的原因可能是不同試驗(yàn)中采用的試驗(yàn)方法的添加水平以及動(dòng)物的耐受程度不同。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)各組間血清生化指標(biāo)差異不顯著，說明1.0%的添加水平不影響湖羊的代謝。同時(shí)，各組均未檢測到高鐵血紅蛋白濃度(＜0.1%)，可能是由于添加水平較低。

4 結(jié)論

① 在湖羊飼糧中添加KNO3，瘤胃液和濃度分別在1和2 h達(dá)到最大值，喂后6～8 h趨近于0。

② 與對照組相比，1.0%組的喂后2、6和8 h的pH顯著提高，1、1.5和2 h的氨態(tài)氮濃度顯著增加;同時(shí)，喂后1.5 h原蟲蛋白和總微生物蛋白質(zhì)濃度及喂后4、8 h乙酸和總揮發(fā)性脂肪酸的濃度顯著提高，喂后 0.5 h、2～6 h丁酸濃度顯著降低，瘤胃發(fā)酵模式傾向于乙酸發(fā)酵。

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