孫麗敏 張海軍 武書庚 岳洪源 王 晶 齊廣海

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實驗室，北京 100081)

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一種新型氧化還原酶的輔酶，于20世紀(jì)70年代末在甲基營養(yǎng)菌被發(fā)現(xiàn)。PQQ廣泛存在于動植物體內(nèi)，但動物自身不能合成，腸道微生物合成和外源攝入是動物組織中PQQ的主要來源，外源PQQ對維持動物機(jī)體正常生理功能至關(guān)重要。被動物攝入后，PQQ在小腸被吸收，經(jīng)腎臟排出。研究表明，PQQ 具有抗氧化應(yīng)激［1］、防治肝損傷［2］、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［3］等功能。日本科學(xué)家曾建議將PQQ定義為新型B族維生素，目前將PQQ劃歸為類維生素。PQQ二鈉(PQQ·Na2)已成為美國、加拿大等國家官方承認(rèn)的膳食組成成分或保健食品。

關(guān)于PQQ在畜牧業(yè)方面的研究較少。本課題組前期研究表明，將PQQ水溶液均勻噴灑于飼料后飼喂，能增強(qiáng)蛋雞的抗氧化能力，提高產(chǎn)蛋率(laying rate，LR)并改善蛋品質(zhì)［4］。維生素 E 是飼料行業(yè)廣泛使用的抗氧化劑，在改善動物機(jī)體抗氧化狀態(tài)的同時，尚具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降低鵪鶉蛋膽固醇含量的作用［5］。PQQ·Na2作為PQQ的商品形式，可作為添加劑直接添加到動物飼糧中，不需要將PQQ溶于水后再與動物飼糧混合的過程，減小了工作量。關(guān)于PQQ·Na2對產(chǎn)蛋雞脂質(zhì)代謝和雞蛋膽固醇含量的影響尚未見報道。因此，本試驗旨在研究將PQQ·Na2直接添加到產(chǎn)蛋雞飼料中，對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能、脂質(zhì)代謝和抗氧化能力的影響，探究PQQ·Na2降低雞蛋膽固醇的可能性，并以維生素E為對照，為PQQ·Na2作為新型飼料添加劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PQQ·Na2由化學(xué)合成，純度 99.9%，為便于均勻混在飼料中，首先用玉米淀粉稀釋PQQ·Na2為0.1%的預(yù)混劑。PQQ·Na2由上海醫(yī)學(xué)生命科學(xué)研究中心有限公司饋贈。

1.2 試驗設(shè)計及飼糧

試驗采用單因子試驗設(shè)計，選取360只產(chǎn)蛋率和體重相近的23周齡京紅1號產(chǎn)蛋雞，隨機(jī)分為5組，為1個對照組和4個試驗組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)12只雞。試驗分預(yù)試期1周和正試期8周2個階段。預(yù)試期各組均飼喂基礎(chǔ)飼糧;正試期，對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼 糧 基 礎(chǔ) 上 添 加 0.08、0.80、1.60 mg/kg PQQ·Na2和100 mg/kg維生素E的飼糧。

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(2004)和《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)，結(jié)合京紅1號產(chǎn)蛋雞飼養(yǎng)手冊配制。試驗采用玉米-豆粕型粉狀飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

半開放式雞舍3層立體籠養(yǎng)，自然光照加人工補(bǔ)光，光照時間16 h/d、強(qiáng)度20 lx，相對濕度50%～90%，縱向負(fù)壓通風(fēng)。每天喂料、撿蛋、清糞各2次，每周消毒2次，自由采食和飲水。常規(guī)防疫和管理。

1.4 指標(biāo)測定和方法

1.4.1 生產(chǎn)性能

正試期，每天以重復(fù)為單位記錄產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重，計算產(chǎn)蛋率和平均蛋重(average egg weight，AEW)。每2周稱剩料，以重復(fù)為單位計算平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料蛋比(the ratio of feed to egg，F(xiàn)/E)。

1.4.2 蛋品質(zhì)

正試期第28、42和56天，每個重復(fù)隨機(jī)選取接近平均蛋重的雞蛋3枚，測定蛋品質(zhì)。蛋殼強(qiáng)度(eggshell strength，ES)、蛋 白 高 度(albumen height，AH)、哈氏單位(Haugh unit，HU)和蛋黃顏色(yolk color，YC)采用以色列ORKA公司生產(chǎn)的系列雞蛋品質(zhì)測定儀測定;蛋形指數(shù)(egg shape index，ESI)采用日本富士坪公司生產(chǎn)的蛋形指數(shù)測定儀測定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4.3 脂質(zhì)代謝

試驗結(jié)束，每重復(fù)隨機(jī)選取體重相近的產(chǎn)蛋雞1只，翅靜脈采血，肝素鈉抗凝，3 600 r/min離心10 min，制備血漿，-20℃保存?zhèn)溆?。屠宰雞只，摘取左側(cè)肝臟，液氮速凍，-80℃保存。肝臟粗脂肪提取方法參考 Folch等［6］，以氯仿-甲醇(v/v，2 ∶1)提取;肝臟總膽固醇(total cholesterol，TC)含量采用市售試劑盒測定。血漿甘油三酯(total triglyceride，TG)、TC、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL-C)含量采用甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶(GPO-PAP)酶法測定，試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司。

1.4.4 雞蛋膽固醇含量

試驗結(jié)束，每重復(fù)隨機(jī)采集雞蛋3枚，稱重，分離蛋黃并稱重。

蛋黃相對重量(%)=(蛋黃重/蛋重)×100。

混勻蛋黃，取樣用于膽固醇含量的測定。雞蛋膽固醇含量以蛋黃膽固醇含量(mg/g)和全蛋膽固醇含量(mg/枚)表示［7］。雞蛋膽固醇含量采用GPO-PAP酶法測定，測定方法參考江均平等［8］，以乙醇提取蛋黃粗脂肪后，用市售試劑盒測定，試劑盒購自北京北化康泰臨床試劑有限公司。

1.4.5 抗氧化能力

血漿和肝臟的丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、總抗氧化能力(T-AOC)均采用試劑盒測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PQQ·Na2對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，與對照組相比，試驗期1～4周，PQQ·Na2對產(chǎn)蛋率無顯著影響(P＞0.05);7～8周、5～8周和 1～8周 0.80 mg/kg PQQ·Na2組的產(chǎn)蛋率顯著高于對照組(P＜0.05);100 mg/kg維生素E對產(chǎn)蛋率無顯著影響(P＞0.05)。試驗期3～4周、5～6周、5～8周和 1～8周，0.80 mg/kg PQQ·Na2組產(chǎn)蛋率均顯著高于100 mg/kg維生素 E 組(P＜0.05)。

與對照組相比，PQQ·Na2對試驗期內(nèi)各階段的平均蛋重?zé)o顯著影響(P＞0.05);3～4周和5～8周，0.08 mg/kg PQQ·Na2組的平均蛋重顯著高于100 mg/kg維生素 E 組(P＜0.05)。

試驗期1～4周，各組平均日采食量沒有顯著差異(P＞0.05)，3～ 4 周，0.80 和 1.60 mg/kg PQQ·Na2組平均日采食量顯著高于對照組;試驗期5～8周和1～8周，各PQQ·Na2組的平均日采食量均顯著高于對照組(P＜0.05)，與維生素E組沒有顯著差異(P＞0.05)。

PQQ·Na2和維生素E對料蛋比無顯著影響(P＞0.05)。

表2 PQQ·Na2對蛋雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of PQQ·Na2 on performance of laying hens

續(xù)表2

2.2 PQQ·Na2對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

由表3可知，PQQ·Na2和維生素E對蛋形指數(shù)、哈氏單位、蛋殼強(qiáng)度和蛋黃顏色無顯著影響(P＞0.05)。42 d，0.80 mg/kg PQQ·Na2和維生素E組的蛋白高度顯著高于對照組(P＜0.05)，1.60 mg/kg PQQ·Na2組的蛋白高度顯著低于維生素 E 組(P＜0.05);56 d，1.60 mg/kg PQQ·Na2組的蛋白高度顯著高于對照組(P＜0.05)，各PQQ·Na2組的蛋白高度與維生素E組沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.3 PQQ·Na2對蛋雞脂質(zhì)代謝和雞蛋膽固醇含量的影響

與對照組相比，1.60 mg/kg PQQ·Na2和維生素E顯著升高血漿TG含量(P＜0.05);PQQ·Na2顯著升高血漿 HDL-C含量(P＜0.05)，對 LDL-C含量無顯著影響(P＞0.05)。與維生素E組相比，0.08 和 0.80 mg/kg PQQ·Na2組血漿 TG 含量顯著低于維生素E組(P＜0.05);各PQQ·Na2組血漿HDL-C含量均高于維生素E組，且0.08 mg/kg PQQ·Na2差異顯著(P＜0.05)，PQQ·Na2對血漿LDL-C含量的影響與維生素E沒有差異(P＞0.05)。PQQ·Na2不影響蛋黃相對重量和蛋黃膽固醇含量(P＞0.05)。與對照組相比，0.80 mg/kg PQQ·Na2可顯著升高肝臟 TC 含量(P＜0.05)、顯著降低 11.27%血漿和全蛋 TC 含量(P＜0.05)，與維生素E組沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.4 PQQ·Na2對蛋雞抗氧化能力的影響

與對照組和維生素E組相比，PQQ·Na2有提高血漿 T-SOD 活性的趨勢(P＞0.05);0.80 mg/kg PQQ·Na2組血漿MDA含量顯著低于對照組(P＜0.05)，與維生素 E 組沒有顯著差異(P＞0.05)，1.60 mg/kg PQQ·Na2組MDA含量與對照組無顯著差異(P＞0.05)，但顯著高于維生素E組(P＜0.05)。與對照組相比，PQQ·Na2能提高肝臟T-SOD活性和 T-AOC，且 0.08 mg/kg PQQ·Na2組差異顯著(P＜0.05);各 PQQ·Na2組肝臟T-SOD活性與維生素E組均無顯著差異(P＞0.05)，T-AOC活性顯著低于維生素 E組(P＜0.05);1.60 mg/kg PQQ·Na2組肝臟 MDA 含量顯著高于對照組和維生素E組(P＜0.05)。

表3 PQQ·Na2對蛋雞蛋品質(zhì)的影響Table 3 Effects of PQQ·Na2 on egg quality of laying hens

表4 PQQ·Na2對蛋雞脂質(zhì)代謝和雞蛋膽固醇含量的影響Table 4 Effects of PQQ·Na2 on lipid metabolism and egg cholesterol content of laying hens

表5 PQQ·Na2對蛋雞抗氧化能力的影響Table 5 Effects of PQQ·Na2 on antioxidant capacity of laying hens

3 討 論

3.1 PQQ·Na2對蛋雞生產(chǎn)性能和雞蛋品質(zhì)的影響

本試驗表明，飼糧中添加 0.80 mg/kg PQQ·Na2能顯著提高蛋雞產(chǎn)蛋率和平均日采食量，對料蛋比無顯著影響。產(chǎn)蛋率的提高可能與PQQ改善動物繁殖機(jī)能［9］有關(guān)，飼喂不含PQQ的純合飼糧的鼠生長緩慢，存活率較低，雌鼠產(chǎn)仔數(shù)降低。PQQ·Na2可能通過改善蛋雞生殖系統(tǒng)功能，進(jìn)而提高產(chǎn)蛋率。蛋雞產(chǎn)蛋率提高的同時，需要從飼糧中攝入更多的營養(yǎng)物質(zhì)滿足生產(chǎn)需要，引起采食量的增加，采食量和產(chǎn)蛋率同時提高，因而料蛋比無顯著變化。本試驗中，與對照組相比，維生素E對蛋雞生產(chǎn)性能無顯著影響，與前人研究結(jié)果［10-12］相符。0.80 mg/kg PQQ·Na2組產(chǎn)蛋率顯著高于維生素E組，表明PQQ·Na2作為蛋雞飼料添加劑較維生素E具有優(yōu)越性。本試驗結(jié)果表明，0.80 和 1.60 mg/kg PQQ·Na2能分別增加42和56 d蛋白高度，改善雞蛋品質(zhì)。

3.2 PQQ·Na2對蛋雞脂質(zhì)代謝和雞蛋膽固醇的影響

維生素E對蛋黃相對重量的影響尚無一致結(jié)論。前人研究資料有維生素E可顯著增加蛋黃相對重量［11，13］和不影響蛋黃相對重量［10］的報道。本試驗結(jié)果顯示，100 mg/kg維生素E對蛋黃相對重量無顯著影響，與 Radwan等［10］結(jié)果相符。0.08和0.80 mg/kg PQQ·Na2有增加蛋黃相對重量的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，250 mg/kgα-生育酚鹽可顯著降低鵪鶉蛋黃中膽固醇含量［5］，維生素E可顯著降低雞蛋蛋黃膽固醇含量［14］;但也有研究［10，12］結(jié)果沒有降低。上述研究均采用蛋黃膽固醇含量(mg/g)表述雞蛋中膽固醇含量。本文中，當(dāng)以蛋黃膽固醇含量表示時，維生素E不能降低雞蛋膽固醇含量，與后2項研究結(jié)果相符。但當(dāng)轉(zhuǎn)換為每枚雞蛋中的膽固醇含量(全蛋膽固醇)時，與對照組相比，維生素E顯著降低了雞蛋膽固醇含量。0.80 mg/kg PQQ·Na2組出現(xiàn)相同效果，且伴隨雞蛋膽固醇含量的降低，出現(xiàn)血漿膽固醇含量降低和肝臟膽固醇含量升高的現(xiàn)象。

雞蛋膽固醇的含量與蛋雞品種、雞齡、飼糧等因素有關(guān)。蛋雞飼糧膽固醇含量一般較低，體內(nèi)膽固醇主要經(jīng)內(nèi)源合成。肝臟和卵巢是主要合成部位，其中肝臟是最活躍的合成部位，也是血液膽固醇的主要來源。蛋雞體內(nèi)的膽固醇主要經(jīng)雞蛋排出(2/3)，此外還通過糞便和膽汁酸代謝途徑排出。PQQ·Na2影響蛋雞膽固醇代謝的原因可能有:1)通過HDL-C介導(dǎo)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程。血液中HDL-C被稱為“好”膽固醇，能介導(dǎo)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程［15］，將外圍組織中膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，經(jīng)膽汁酸途徑排出。本試驗中，PQQ·Na2顯著升高了血 漿 HDL-C 含 量，0.80 和 1.60 mg/kg PQQ·Na2顯著升高了肝臟膽固醇含量，說明PQQ·Na2可能通過增加血液HDL-C含量，促進(jìn)血液膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟，促進(jìn)膽固醇經(jīng)膽汁酸途徑排出。2)通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(PGC-1α)間接調(diào)控膽固醇-7-α羥化酶(CYP7A1)的作用。研究表明，PQQ可激活PGC-1α啟動子，增加PGC-1α的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)［16］，而 PGC-1α 可激活 CYP7A1。CYP7A1是催化膽固醇轉(zhuǎn)化為中性膽汁酸的主要酶，體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞在注射表達(dá)PGC-1α的重組體腺病毒后，可直接激活CYP7A1基因的表達(dá);在培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染分析中，PGC-1α可激活CYP7A1的啟動子［17］。PQQ·Na2可能通過增加PGC-1α的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)CPY7A1基因的表達(dá)，增加膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出，從而有利于雞蛋膽固醇含量的降低。然而，本試驗中，不同劑量PQQ·Na2對雞蛋膽固醇含量的影響呈現(xiàn)不規(guī)律性。原因可能是低濃度(0.08 mg/kg)PQQ·Na2對蛋雞體內(nèi)膽固醇代謝影響較弱，不能表現(xiàn)明顯的降雞蛋膽固醇作用。對于高濃度(1.60 mg/kg)PQQ·Na2組而言，血漿HDL-C含量升高，介導(dǎo)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)過程，引起肝臟膽固醇含量升高，同時，高濃度PQQ·Na2可能對CPY7A1基因表達(dá)影響較大，加速膽汁酸腸肝循環(huán)，使以糞便中游離膽鹽形式排出的膽固醇增加。但機(jī)體為了維持正常的腸肝循環(huán)，彌補(bǔ)膽鹽損失，肝臟可能通過合成更多的膽固醇以補(bǔ)充隨糞便排泄掉的部分，同時多余的膽固醇進(jìn)入血液和雞蛋。因此，高濃度PQQ·Na2升高肝臟膽固醇含量的同時，并沒有引起血液和雞蛋膽固醇含量的降低。不同劑量PQQ·Na2對雞蛋膽固醇含量產(chǎn)生的影響不同，說明PQQ·Na2對雞蛋膽固醇含量的影響存在劑量關(guān)系。本試驗中PQQ·Na2梯度設(shè)置較少，關(guān)于PQQ·Na2對膽固醇代謝的規(guī)律性影響，還有待進(jìn)一步研究。

3.3 PQQ·Na2對蛋雞抗氧化能力的影響

PQQ具有較強(qiáng)的抗氧化能力，約能參與2萬個氧化還原循環(huán)而不發(fā)生自身氧化或多聚反應(yīng)。PQQ能降低缺血/再灌注模型下心肌組織［18］內(nèi)MDA含量的升高，防止高氧應(yīng)激引起的嚙齒動物認(rèn)知能力的下降［19］。維生素E是飼料行業(yè)廣泛使用的抗氧化劑，能緩解蛋雞機(jī)體受到的氧化應(yīng)激［20］。本試驗中，與對照組相比，PQQ·Na2和維生素 E不影響血漿 T-SOD活性，0.80 mg/kg PQQ·Na2和100 mg/kg維生素E顯著降低了血漿MDA含量;PQQ·Na2和維生素E均能提高肝臟T-SOD活性和T-AOC，顯示PQQ·Na2和維生素E均能改善蛋雞機(jī)體抗氧化能力。

本試驗中，1.60 mg/kg PQQ·Na2組血漿和肝臟MDA含量均增加，可能與不同條件下PQQ表現(xiàn)出促氧化能力有關(guān)［21］。在氧氣(O2)存在時，PQQ與還原型輔酶Ⅱ［NAD(P)H］反應(yīng)，伴隨過氧化氫(H2O2)和過氧根離子(O-2)的產(chǎn)生［22］，PQQ的過量攝入可能加速活性氧的產(chǎn)生，增加其毒性。本試驗中，MDA含量的增加可能因1.60 mg/kg PQQ·Na2含量較高，活性氧產(chǎn)生較多，增加其攻擊脂質(zhì)的可能，增加脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。此外，血漿MDA含量的略微增加也可能由該組血漿膽固醇含量升高所致。肝臟MDA含量增加說明1.60 mg/kg PQQ·Na2可能對蛋雞機(jī)體造成一定程度的負(fù)面影響。但以往文獻(xiàn)研究表明PQQ·Na2安全性較好:小鼠口服250～2 000 mg/kg體重的PQQ對其紅細(xì)胞核沒有影響［23］;體外基因毒性試驗表明，PQQ不會引起染色體的變化。給大鼠飼喂2 000 mg/kg體重的PQQ·Na2，未見基因毒性［24］。關(guān)于 PQQ·Na2在產(chǎn)蛋雞上的安全劑量有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①本試驗條件下，PQQ·Na2能提高蛋雞產(chǎn)蛋率，0.80 mg/kg組生產(chǎn)性能優(yōu)于100 mg/kg維生素E組;PQQ·Na2對雞蛋品質(zhì)影響不大，可在一定程度上增加蛋白高度。

②PQQ·Na2可能通過升高蛋雞血漿HDL-C含量介導(dǎo)逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)膽汁酸途徑，有利于降低雞蛋膽固醇含量。

③PQQ·Na2可增強(qiáng)蛋雞機(jī)體抗氧化能力，降低蛋雞血漿MDA含量，升高肝臟T-SOD活性和T-AOC。

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