黃循銣，王瑞幸，王承黨

2.福建醫(yī)科大學(xué) 生理學(xué)與病理生理學(xué)系，福州 350004

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的終身性疾病，主要表現(xiàn)為非特異性結(jié)、直腸炎癥。目前UC主要治療藥物有氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、生物制劑及中藥[1]，益腸平是民間治療UC有效的中藥復(fù)方。本文采用2.5%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）定量灌胃誘導(dǎo)小鼠UC，并通過測(cè)定結(jié)腸損傷大體評(píng)分（macroscopic assessment of colonic damage，MACN）、結(jié)腸通透性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、結(jié)腸組織超氧化歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），評(píng)價(jià)益腸平對(duì)UC小鼠結(jié)腸通透性的預(yù)防作用，并初步了解其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性ICR小鼠120只，8～10周齡，體質(zhì)量（27±2）g[福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（閩）2009－0002]。

1.1.2 試劑及儀器 益腸平（由連翹、蚤休及泡山甲等12種中藥組成）生藥濃度1.235g／mL，由福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系提供；DSS（批號(hào)：4455H，美國(guó)ICN公司）；伊文思蘭（批號(hào)：104K3717，美國(guó)Sigma公司）；iNOS一抗（批號(hào)：9242P503B，美國(guó) Labvision公司）；二步法抗兔免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：GK400305，廣州基因有限公司）；柳氮磺吡啶（Sulfasalazine suppositories，SASP，批號(hào)20090523，上海三維制藥有限公司）；SOD（批號(hào)20090413）、MDA（批號(hào)20090421）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。正置顯微鏡（BX50F型，日本Olympus optical有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎儀（GE50型，美國(guó)Thomas scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組 小鼠隨機(jī)分為6組，每組20只：（1）正常 對(duì)照組；（2）模型對(duì)照組；（3）SASP 組；（4）益腸平高劑量組（YCP1）；（5）益腸平中劑量組（YCP2）；（6）益腸平低劑量組（YCP3）。

1.2.2 UC模型制作 模型對(duì)照組、SASP組及YCP1、YCP2及 YCP3組每天分別于10：00、14：00和18：00給予2.5%DSS溶液定量灌胃，每次30mL／kg，每天末次灌胃后給予足量混合配方顆粒飼料，次日08：00取走飼料，連續(xù)9d；正常對(duì)照組以蒸餾水代替2.5%DSS[2]。

1.2.3 治療 造模開始同時(shí)給藥：YCP1、YCP2及YCP3組分別給予相同容積（0.125mL／10g體質(zhì)量）、不同生藥濃度（0.617、0.308、0.154g／mL）的益腸平溶液，每日2次，即每只小鼠用藥量分別為30.8、15.4、7.7g·kg－1·d－1。SASP組給予相同容積（0.125mL／10g體質(zhì)量）的0.8%SASP懸液，每日2次。以上藥液均為灌胃，給藥時(shí)間距DSS給藥時(shí)間2h，連續(xù)9d。正常對(duì)照組及模型對(duì)照組以蒸餾水代藥[2]。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)

1.3.1 MACN評(píng)分 各組隨機(jī)取10只小鼠脫頸椎處死，取全結(jié)腸，漂洗后于解剖顯微鏡下觀察及評(píng)分。MACN＝潰瘍?cè)u(píng)分＋粘連評(píng)分＋糞便評(píng)分。潰瘍?cè)u(píng)分：0分：正常；1分：局部水腫、無(wú)潰瘍；2分：一個(gè)潰瘍，無(wú)增厚、水腫；3分：一個(gè)潰瘍伴增厚、水腫；4分：最明顯的潰瘍沿腸壁縱軸的長(zhǎng)度＞1cm；5～10分：潰瘍長(zhǎng)度沿結(jié)腸縱軸＞2cm（每一潰瘍?cè)黾?cm增加1分）。粘連評(píng)分：0分：無(wú)；1分：較少；2分：較多，不易分離。稀便：0分：無(wú)；1分：有[3]。

1.3.2 結(jié)腸通透性測(cè)定 取余下10只小鼠禁食不禁水24h，經(jīng)肛門插入直徑為1mm硅膠管，注入0.5%肥皂水洗腸，15min后用清水沖洗2次。洗腸后30min，氯胺酮麻醉下自小鼠結(jié)腸給予1.5%伊文思蘭0.2mL，立即縫合肛門。15min后處死小鼠，取全結(jié)腸，剪開腸腔，用6mmol／L N－乙酰半胱氨酸漂洗。將腸段置于恒溫箱37℃12h烘干，稱重后放入1mL甲酰胺55℃孵育24h，取100μL孵育液于酶標(biāo)儀上測(cè)定620nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算伊文思藍(lán)量。以進(jìn)入腸壁內(nèi)伊文思蘭的量（μg／mg腸段質(zhì)量）反映結(jié)腸通透性[4]。

1.3.3 結(jié)腸組織MDA及SOD測(cè)定 取病變最明顯處0.5cm結(jié)腸組織，制備10%組織勻漿，經(jīng)3次凍融后離心取上清液提純。結(jié)腸黏膜MDA及SOD的測(cè)定按試劑盒說明進(jìn)行[4]。

1.3.4 結(jié)腸組織iNOS測(cè)定 取病變較明顯的部位0.5cm，常規(guī)固定、包埋、切片，采用免疫組織化學(xué)Envison TM二步法測(cè)定。結(jié)腸iNOS表達(dá)以細(xì)胞漿染為棕色或淺棕色為陽(yáng)性，采用Image Pro－Plus 5.1圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。比較各組小鼠結(jié)腸組織單位面積陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 MACN評(píng)分 造模后3d模型小鼠均逐漸出現(xiàn)腹瀉、血便、消瘦等類似人類UC的表現(xiàn)。造模后9d正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜光整，模型對(duì)照組結(jié)腸短縮，黏膜充血水腫明顯，見淺表潰瘍形成，部分見息肉樣隆起，其余各組結(jié)腸黏膜充血水腫較模型對(duì)照組減輕。模型對(duì)照組MACN評(píng)分較正常對(duì)照組顯著增高，SASP組、YCP1、YCP2、YCP3組較模型對(duì)照組顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。YCP1、YCP2、YCP3組與SASP組比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.2 結(jié)腸通透性 正常對(duì)照組結(jié)腸粘膜光整，少許呈淡藍(lán)色；模型對(duì)照組結(jié)腸粘膜充血水腫，病變處呈深藍(lán)色。模型對(duì)照組結(jié)腸通透性較正常對(duì)照組顯著增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SASP組及YCP1、YCP2、YCP3組較模型對(duì)照組顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SASP組較 YCP1、YCP2、YCP3組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 結(jié)腸組織MDA、SOD水平 模型對(duì)照組較正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸MDA水平顯著增高、SOD水平顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SASP組、YCP1、YCP2、YCP3組與模型對(duì)照組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SASP組與 YCP1、YCP2、YCP3組比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.4 結(jié)腸組織iNOS表達(dá) 正常對(duì)照組iNOS無(wú)表達(dá)或僅少量表達(dá)于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的胞漿。模型對(duì)照組較正常對(duì)照組表達(dá)明顯增多，陽(yáng)性區(qū)域位于結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞，腸腺上皮細(xì)胞，炎癥細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿。模型對(duì)照組iNOS陽(yáng)性單位數(shù)值較正常對(duì)照組顯著增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；SASP組、YCP1、YCP2、YCP3組較模型對(duì)照組顯著降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SASP組較YCP2、YCP3組表達(dá)較低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1，表1）。

表1 各組小鼠MACN評(píng)分、結(jié)腸通透性（EB／腸質(zhì)量）、結(jié)腸MDA、SOD及iNOS的表達(dá)情況Tab 1 MACN，colonic permeability，MDA，SOD and iNOS expression level in different groups mouse

2.5 結(jié)腸通透性、MACN 評(píng)分、MDA、SOD 及iNOS的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析提示，小鼠結(jié)腸通透性與 MACN評(píng)分（r＝0.511，P＝0.009）、MDA（r＝0.470，P＝0.011）、iNOS（r＝0.542，P＝0.006）均有顯著正相關(guān)；與SOD（r＝－0.520，P＝0.007）呈顯著負(fù)相關(guān)。

3 討 論

UC以腹痛、腹瀉及黏液血便為主要癥狀，其發(fā)病機(jī)制未明。近年來，結(jié)腸屏障受損、結(jié)腸通透性增高逐漸成為UC發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)。結(jié)腸屏障由機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和生物屏障組成。當(dāng)結(jié)腸屏障受損后，結(jié)腸通透性增高，腸腔內(nèi)的細(xì)菌或食物等抗原進(jìn)入腸壁，啟動(dòng)腸道粘膜免疫反應(yīng)進(jìn)而導(dǎo)致腸道免疫及炎癥反應(yīng)。通過人類炎性腸病患者及一些動(dòng)物模型的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，腸道通透性的改變?cè)诩膊“l(fā)病數(shù)月之前就已出現(xiàn)，它可能是UC起病及反復(fù)發(fā)作的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[5]。本研究采用2.5%DSS定量灌胃成功誘發(fā)小鼠UC，造模小鼠出現(xiàn)明顯的腹瀉、粘液血便，類似人類UC。UC小鼠結(jié)腸通透性與MACN明顯增高并呈密切正相關(guān)。與模型組比較，益腸平治療組MACN及結(jié)腸通透性明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示益腸平對(duì)UC小鼠結(jié)腸大體病理表現(xiàn)及降低結(jié)腸通透性均有顯著的改善作用。

腸道通透性受TNF－α等多種前炎癥因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，并與腸黏膜的氧化應(yīng)激狀況有關(guān)[4]。液體及溶質(zhì)主要通過經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和細(xì)胞旁路途徑兩種方式進(jìn)入結(jié)腸黏膜，后者主要是通過黏膜上皮細(xì)胞間的緊密連接來實(shí)現(xiàn)，是中、大分子通過腸道屏障的重要途徑。已有研究表明，結(jié)腸自由基產(chǎn)生增加，可導(dǎo)致結(jié)腸屏障受損，結(jié)腸通透性增高[4]。自由基包括氧自由基和NO自由基，SOD反映了組織清除氧自由基的能力，而MDA則是脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，它們反映了細(xì)胞受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度。而測(cè)定結(jié)腸組織iNOS，可以反映結(jié)腸NO自由基損傷程度。

益腸平由銀花、連翹、蒲公英、蚤休、茵陳以及赤芍等12種中藥組成。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明，本方所含的銀花、連翹、蒲公英、蚤休對(duì)結(jié)腸桿菌、痢疾桿菌等腸道細(xì)菌有較強(qiáng)的抗菌作用；連翹有降低血管內(nèi)皮滲透性的作用；茵陳有清熱抑菌，抑制腸管過度蠕動(dòng)的作用。本配方是在用于臨床治療泄瀉的經(jīng)驗(yàn)方取得較好療效的基礎(chǔ)上，結(jié)合本病以免疫異常及感染為主要因素的發(fā)病機(jī)制，以健脾滲濕、去腐排膿、生肌斂瘡為治則配方而成，旨在消除潰瘍、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)炎癥吸收的作用。本研究結(jié)果提示，UC小鼠結(jié)腸SOD水平明顯降低，MDA及iNOS水平明顯增高，顯示UC小鼠結(jié)腸受自由基損傷明顯，益腸平治療后上述指標(biāo)明顯改善，并呈劑量依賴性。各組小鼠自由基水平與結(jié)腸通透性密切相關(guān)，提示益腸平可能通過降低結(jié)腸黏膜自由基水平而降低結(jié)腸通透性。

綜上所述，益腸平能有效改善UC小鼠結(jié)腸通透性，這可能基于其可有效降低UC小鼠結(jié)腸自由基損傷、保護(hù)結(jié)腸屏障，但其進(jìn)一步的分子機(jī)制尚需今后進(jìn)一步研究。

[1]王瑞幸，黃循銣，方秋娟，等.補(bǔ)黃丹對(duì)小鼠免疫性潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，40（1）：37－39.

[2]黃循銣，王承黨，王瑞幸.葡聚糖硫酸鈉自由飲用與定量灌胃誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎模型的對(duì)比研究[J].胃腸病學(xué)，2009，14（1）：27－30.

[3]Fitzpatrick L R，Small J S，Doblhofer R，etal.Vidofludimus inhibits colonic interleukin－17and improves hapten－induced co－litis in rats by a unique dual mode of action[J].Pharmacol ExpTher，2012，342（3）：850－860.

[4]黃循銣，王瑞幸，王承黨.小鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸通透性改變及其與自由基的關(guān)系[J].中華消化雜志，2010，3（1）：557－559.

[5]Yan Y，Laroui H，Ingersoll A，etal.Overexperssion of Ste20－related proline／alanine－rich kinase exacerbates experimental colitis in mice[J].JImmunol，2011，187（3）：1496－1505.