封全靈，劉弘揚

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州450052

△女，1965年4月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向:婦科腫瘤，E-mail:zzufql@126.com

孕激素促進(jìn)子宮平滑肌瘤生長的確切機(jī)制尚不清楚。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為子宮平滑肌瘤的形成和生長主要與孕激素核內(nèi)受體發(fā)揮的基因組作用有關(guān)，而越來越多的研究［1］表明孕激素還可以通過核外孕激素受體(progesterone receptor，PR)發(fā)揮快速的非基因組作用。PR-M 是2003年發(fā)現(xiàn)的定位于線粒體外膜的PR［2］，它在孕激素誘導(dǎo)下使得線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)增加，從而抑制原代培養(yǎng)、永生化子宮平滑肌細(xì)胞和乳癌細(xì)胞的凋亡［3-4］。研究［5］表明PR-M 的分布與線粒體有關(guān)，在子宮平滑肌、心臟和肝臟中均高表達(dá)。porin蛋白是參與形成線粒體外膜小孔的線粒體標(biāo)志性蛋白，調(diào)節(jié)能量代謝和細(xì)胞凋亡［6-7］。作者采用RTPCR 方法分別檢測PR-M 和porin mRNA 在子宮平滑肌瘤及肌瘤旁正常平滑肌組織中的表達(dá)情況，同時檢測相應(yīng)標(biāo)本中傳統(tǒng)孕激素受體PR-A、PR-B mRNA 的表達(dá)，分析3 種PR 與porin 表達(dá)的相關(guān)性，探討其參與子宮平滑肌瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2012年10月至12月于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科因子宮平滑肌瘤行子宮切除術(shù)的患者28例，年齡39～57(45.8±3.9)歲?；颊呔鶡o其他合并癥，術(shù)前至少半年未服用類固醇激素，通過末次月經(jīng)時間和病理證實患者子宮內(nèi)膜均處于增殖期。術(shù)中取平滑肌瘤組織標(biāo)本為研究組，取相應(yīng)瘤旁正常子宮平滑肌組織為對照組。標(biāo)本均經(jīng)病理證實，該研究獲得患者知情同意。

1.2 PR 和porin mRNA 的檢測 采用RT-PCR 方法。取新鮮離體組織1 g，－80℃低溫凍存。Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq 酶、dNTP 及分子量標(biāo)準(zhǔn)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PR-A、PR-B、PR-M和線粒體porin RT-PCR 引物由鄭州寶科生物科技公司合成，引物序列見表1。首先提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。產(chǎn)物采用20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳后顯色，以目的基因與內(nèi)參β-actin 灰度值比值作為目的基因的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。2組PR-M、PR-A、PR-B 與porin mRNA 表達(dá)水平的比較采用配對t 檢驗。PR-M、PR-A、PR-B與porin mRNA 表達(dá)水平之間的關(guān)系采用Pearson 積差相關(guān)分析評價，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組PR-M、PR-A、PR-B 和porin mRNA 表達(dá)的比較 見圖1和表2。

圖1 對照組(1)和研究組(2)PR-A、PR-B、PR-M 和porin mRNA 的表達(dá)

表2 2組PR-M、PR-A、PR-B 和porin mRNA 表達(dá)水平的比較

2.2 相關(guān)性分析 見表3。研究組PR-M 與porin mRNA 的表達(dá)呈正相關(guān)。

表3 PR-M、PR-A、PR-B 與porin mRNA 相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

3.1 PR-M 在子宮平滑肌瘤組織中的表達(dá) PR 屬于配體激活核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，傳統(tǒng)PR 主要指PR-A 和PR-B，分布于胞核和胞漿。近些年來發(fā)現(xiàn)了一些新型PR，如PR-C、PR-M 和PR-T 等。PRM 是2002年從人主動脈細(xì)胞和脂肪組織cDNA 文庫中克隆到的定位于線粒體外膜的PR，含有314 個氨基酸，cDNA 約為2 230 bp。同PR-A 和PR-B 相比，PR-M 含有激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)，缺乏氨基末端A/B 結(jié)合域、DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核定位信號區(qū)，所以是一種截短的PR。PR-M 氨基末端的16 個氨基酸構(gòu)成序列中包含的線粒體定位序列與其獨特的線粒體定位功能有關(guān)。已有研究［3］表明PR-M 在人子宮平滑肌瘤和正常子宮平滑肌中均有表達(dá)，并且子宮平滑肌瘤組織中表達(dá)高于正常子宮平滑肌。該研究結(jié)果顯示，人子宮平滑肌瘤和瘤旁正常子宮平滑肌組織中均存在PR-M mRNA，并且子宮平滑肌瘤組織中的表達(dá)高于正常子宮平滑肌組織，表明PR-M 在子宮平滑肌瘤生長過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。子宮平滑肌瘤組織中PR-A 和PR-B mRNA 表達(dá)較高，與報道［8］相一致，再次證實孕激素可以通過基因組效應(yīng)在肌瘤組織中發(fā)揮作用。

3.2 線粒體外膜孔蛋白porin mRNA 的表達(dá) 線粒體外膜孔蛋白porin 也稱電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channels，VDAC)，是形成線粒體外膜小孔的主要蛋白成分［6］。VDAC 通過調(diào)節(jié)線粒體和胞漿之間的離子交換，參與腫瘤、心臟病和神經(jīng)變性疾病等多種疾病的發(fā)生［9］，可作為線粒體外膜的標(biāo)志蛋白［10］。該研究結(jié)果表明，porin mRNA 在子宮平滑肌瘤組織中的表達(dá)明顯高于瘤旁正常子宮平滑肌組織，提示肌瘤組織細(xì)胞線粒體功能較鄰近平滑肌組織活躍。

3.3 子宮平滑肌瘤中3 種PR 和porin mRNA 的關(guān)系 采用孕激素或者PR 激動劑R5020 分別處理MCF-10A 細(xì)胞(缺乏核PR 表達(dá)的良性乳腺細(xì)胞，表達(dá)PR-M)和人永生化子宮平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞MMP 增加，與細(xì)胞內(nèi)ATP 水平增高一致，這種作用可以被PR 拮抗劑抑制，卻不受基因轉(zhuǎn)錄抑制劑放線銅菌的影響［3-4］，提示孕激素通過PR-M 非基因組作用增加能量代謝。另外有證據(jù)［11］表明PR-B 可以通過非基因組作用介導(dǎo)Src 激酶的活化，激活MAPK 途徑，進(jìn)而誘導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)。該研究結(jié)果顯示，子宮平滑肌瘤組織中PR-M 與porin mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)，PR-A、PR-B 與porin mRNA 無相關(guān)性。另外，曾有研究［3］從蛋白水平上證實子宮平滑肌瘤組織中PR-M 與porin 表達(dá)呈正相關(guān)。由此推斷PR-M 在平滑肌瘤組織中的表達(dá)升高可能與線粒體外膜功能活躍有關(guān)，PR-M 可能通過非基因組作用影響線粒體外膜功能，加強(qiáng)細(xì)胞呼吸并抑制線粒體途徑調(diào)節(jié)的細(xì)胞凋亡，從而參與子宮平滑肌瘤的發(fā)生發(fā)展。

［1］Gellersen B，F(xiàn)ernandes MS，Brosens JJ.Non-genomic progesterone actions in female reproduction［J］.Hum Reprod Update，2009，15(1):119

［2］Dai Q，Shah AA，Garde RV，et al.A Truncated progesterone receptor(PR-M)localizes to the mitochondrion and controls cellular respiration［J］.Mol Endocrinol，2013，27(5):741

［3］封全靈.PR-M 對子宮平滑肌細(xì)胞線粒體膜電位作用的研究［D］.鄭州:鄭州大學(xué)，2010.

［4］Behera MA，Dai Q，Garde R，et al.Progesterone stimulates mitochondrial activity with subsequent inhibition of apoptosis in MCF-10A benign breast epithelial cells［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2009，297(5):E1089

［5］Saner KJ，Welter BH，Zhang F，et al.Cloning and expression of a novel，truncated，progesterone receptor［J］.Mol Cell Endocrinol，2003，200(1/2):155

［6］Shoshan-Barmatz V，Israelson A，Brdiczka D，et al.The voltage-dependent anion channel (VDAC):function in intracellular signalling，cell life and cell death［J］.Curr Pharm Des，2006，12(18):2249

［7］Young MJ，Bay DC，Hausner G，et al.The evolutionary history of mitochondrial porins［J］.BMC Evol Biol，2007，7:31

［8］Viville B，Charnock-Jones DS ，Sharkey AM ，et al .Distribution of the A and B forms of the progesterone receptor messenger ribonucleic acid and protein in uterine leiomyomata and adjacent myometrium［J］.Human Reprod，1997，12(4):815

［9］Shoshan-Barmatz V，De Pinto V，Zweckstetter M，et al.VDAC，a multi-functional mitochondrial protein regulating cell life and death［J］.Mol Aspects Med，2010，31(3):227

［10］Rapizzi E，Pinton P，Szabadkai G，et al.Recombinant expression of the voltage-dependent anion channel enhances the transfer of Ca2+microdomains to mitochondria［J］.J Cell Biol，2002，159(4):613

［11］Faivre EJ，Lange CA.Progesterone receptors upregulate Wnt-1 to induce epidermal growth factor receptor transactivation and c-Src-dependent sustained activation of Erk1/2 mitogen-activated protein kinase in breast cancer cells［J］.Mol Cell Biol，2007，27(2):466