楊偉偉 李浩明 金國(guó)華△ 田美玲 秦建兵

1（南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京210023）

2（南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)系，江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南通226001）

本課題組在近年來(lái)的系列研究中發(fā)現(xiàn)，切割穹窿海馬傘側(cè)海馬提取液更能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）向神經(jīng)元或乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）陽(yáng)性的膽堿能神經(jīng)元分化［1］；在海馬提取液的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，切割組與正常組間有多條差異蛋白條帶，其中56kD蛋白的條帶具有誘導(dǎo)NSCs遷移和向神經(jīng)元分化的作用［2，3］；進(jìn)而對(duì)56kD蛋白進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）分析，發(fā)現(xiàn)其中含有磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白 （phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）［4］。海馬膽堿能刺激肽（hippocampal cholinergic neurostimulating peptide，HCNP）是 PEBP N末端11個(gè)氨基酸組成的小分子片段。體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，HCNP能夠提高培養(yǎng)神經(jīng)元中ChAT的活性，使乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）表達(dá)量增加，并能與神經(jīng)生長(zhǎng)因子 （nerve growth factor，NGF）一起促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元的分化［5］。本研究在體外培養(yǎng)海馬齒狀回NSCs培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)液中加入HCNP，以便更好地研究HCNP在NSCs向神經(jīng)元或某些特定神經(jīng)元分化過(guò)程中所起的作用。

1 材料和方法

1．1 切割穹窿海馬傘側(cè)海馬提取液的制備

220-250gSD大鼠6只，雌雄不拘，腹腔注射復(fù)合麻醉劑Chlorpent（0．2ml／100g），待動(dòng)物麻醉后固定于立體定位儀上，暴露前囟，確定前囟坐標(biāo)A（矢狀軸）、L（冠狀軸）、V（垂直軸），根據(jù)Paxinos和Watson圖譜確定右側(cè)海馬傘的切割范圍。先在顱骨上確定兩點(diǎn)：（1）A1＝A-1．4、L1＝L-1和（2）A2＝A-1．4、L2＝L-4，切割深度為 V1，2＝ V＋5．4。在兩點(diǎn)間劃開(kāi)一條骨縫，將針刀插入腦內(nèi)至切割深度，左右往返切割3次后退出針刀，待無(wú)顱內(nèi)出血后，縫合皮膚，肌注青霉素，按性別分籠飼養(yǎng)至14天后，水合氯醛麻醉后，速剝?nèi)ヮ^部皮膚，置于4℃無(wú)菌生理鹽水中去除顱骨，沿大腦縱裂切斷胼胝體，證實(shí)右側(cè)穹窿海馬傘確被切斷后，取出切割側(cè)海馬，移至無(wú)菌玻璃研磨器中，按照1ml／100g加入4℃基礎(chǔ)培養(yǎng)液，充分研磨后移至5ml離心管中，于4℃下12 000r／min離心10分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移，并凍存于-20℃冰箱中備用。

1．2 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)

孕17dSD大鼠經(jīng)腹腔注射復(fù)合麻醉劑（0．2 ml／100g），消毒后無(wú)菌條件下取出胎鼠，置于無(wú)菌血清DMEM／F12培養(yǎng)基中，取出海馬組織，剔除腦膜、脈絡(luò)膜及血管等結(jié)締組織，無(wú)菌DMEM／F12培養(yǎng)基清洗數(shù)次后，加入accutase于37℃消化20min，加入血清終止消化。去除上清后，加入2ml無(wú)血清DMEM／F12培養(yǎng)液，用吸管吹打成單細(xì)胞懸液，并經(jīng)孔徑為70μm篩網(wǎng)過(guò)濾后，1000r／min離心10 min。棄上清，加入3ml加入由無(wú)血清DMEM／F12培養(yǎng)基、2%B27、bFGF及EGF配置的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至50ml培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期觀察原代神經(jīng)干細(xì)胞球生長(zhǎng)情況。

1．3 HCNP對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化

將培養(yǎng)7d的原代神經(jīng)干細(xì)胞球轉(zhuǎn)吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至5ml離心管中，1000r／min離心5 min。棄上清，加入2ml神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打均勻，1000r／min離心5min后，棄上清，加入1ml神經(jīng)元分化培養(yǎng)液（DMEM／F12＋2%B27）。用臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)細(xì)胞，按2×104個(gè)／孔接種于預(yù)先放置涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1ml神經(jīng)元分化培養(yǎng)液。每板分成3組，每組8孔，各組分別加入：（1）聯(lián)合培養(yǎng)組：10μl切割穹窿海馬傘側(cè)海馬提取液及50μl（1pg／μl）HCNP；（2）HCNP組：10μl切割穹窿海馬傘側(cè)海馬提取液；（3）空白對(duì)照組只加入神經(jīng)元分化培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板放入飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并定期于倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)干細(xì)胞分化情況。

1．4 Tuj-1免疫熒光檢測(cè)

干細(xì)胞分化培養(yǎng)第14d時(shí)分別進(jìn)行Tuj-1和MAP-2免疫熒光檢測(cè)。去除各孔中的培養(yǎng)液，用0．01mol／L PBS（pH 7．2）緩沖液清洗3遍，每孔加入1ml 100%甲醇，4℃固定10min，去除甲醇后加入4%多聚甲醛4℃固定30min，去除多聚甲醛溶液，0．01mol／L PBS（pH 7．2）緩沖液清洗數(shù)遍后，加入含10%山羊血清的0．01mol／L PBS（pH 7．2）配置的封閉液，4℃封閉過(guò)夜。第二天去除抗體封閉液，加入1∶100稀釋的鼠抗Tuj-1和兔抗MAP-2多克隆抗體（Chemicon公司），室溫下輕搖1h后放4℃冰箱中孵育，兩天后去除一抗，0．01mol／L PBS（pH 7．2）緩沖液清洗3遍，再加入1∶500 稀釋的山羊抗小鼠568或羊抗兔568抗體200μl，避光4℃孵育過(guò)夜，次日清晨除去抗體，0．01mol／L PBS（pH7．2）緩沖液清洗3遍，每孔再加入200μl 1∶1000稀釋的Hochest，避光4℃孵30min，去除Hochest，0．01mol／L PBS（pH 7．2）緩沖液清洗3遍、20%甘油緩沖液封片，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)Tuj-1陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目，并觀察胞體和突起的生長(zhǎng)情況。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2．1 Tuj-1免疫熒光檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

Tuj-1檢測(cè)結(jié)果顯示，HCNP與切割穹窿海馬傘側(cè)海馬提取液聯(lián)合培養(yǎng)組（見(jiàn)圖1A，B，C）中Tuj-1陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯多于HCNP組（見(jiàn)圖1D，E，F(xiàn)）和對(duì)照組（見(jiàn)圖1G，H，I），并且神經(jīng)元突起在數(shù)量、粗細(xì)和長(zhǎng)度上明顯優(yōu)于其他兩組；HCNP組Tuj-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，神經(jīng)元胞體較對(duì)照組大，突起較長(zhǎng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，單因素方差分析中各組之均有顯著差異（P＜0．05）；HCNP與切割穹窿海馬傘側(cè)海馬提取液聯(lián)合培養(yǎng)組中細(xì)胞Tuj-1陽(yáng)性率為10．641±3．079%（P＜0．05）；HCNP組細(xì)胞Tuj-1陽(yáng)性率為5．634±1．874%（P＜0．05）；空白對(duì)照組中細(xì)胞Tuj-1陽(yáng)性率為2．254±0．832%（P＜0．05）。同時(shí)，使用捷達(dá)801圖像處理系統(tǒng)對(duì)Tuj-1陽(yáng)性神經(jīng)元成熟度（神經(jīng)元周長(zhǎng)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中HCNP＋切割海馬傘海馬提取液組為（1376．18±388．89）μm，HCNP組為（640．07±137．53）μm，空白對(duì)照組為（220．45±79．87）μm。

圖1 Tuj-1與Hoechst免疫熒光檢測(cè)（400×）Fig 1 The neurons differentiated from NSCs in plate were detected by Tuj-1immunofluorescence（400×）

圖2 各組間細(xì)胞Tuj-1陽(yáng)性率對(duì)照Fig 2 The percentages of Tuj-1neurons in different groups．

2．2 MAP-2免疫熒光檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析

MAP-2免疫熒光檢測(cè)結(jié)果與Tuj-1免疫熒光檢測(cè)結(jié)果相似（具體見(jiàn)圖3和圖4）捷達(dá)801圖像處理系統(tǒng)對(duì)MAP-2陽(yáng)性神經(jīng)元周長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，HCNP與切割海馬傘海馬提取液聯(lián)合培養(yǎng)組為（2050．10±496．38）μm，HCNP組為（1140．55±281．32）μm，空白對(duì)照組為（613．73±136．60）μm。

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）具有分裂、增殖特性和多分化潛能，這就使其成為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性病變的理想細(xì)胞。但是影響NSCs分化為神經(jīng)元的因素十分復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)大部分的NSCs都分化成為膠質(zhì)細(xì)胞，僅有少數(shù)的分化為神經(jīng)元［6］。NSCs需要在一系列因子連續(xù)的協(xié)同作用下才能向神經(jīng)元或特定表型的神經(jīng)元分化，如BDNF、NGF、PDGF、5-HT等等。

圖3 MAP-2與Hoechst免疫熒光檢測(cè)（200×）Fig 3 The neurons differentiated from NSCs in plate were detected by MAP-2immunofluorescence（200×）

圖4 各組間細(xì)胞MAP-2陽(yáng)性率對(duì)照Fig 4 The percentages of MAP-2neurons in different groups

HCNP是今年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類與神經(jīng)元向膽堿能神經(jīng)元定向分化相關(guān)的小分子肽片段。它由PEBP N末端的11個(gè)氨基酸組成，研究發(fā)現(xiàn)人海馬HCNP在25～30周胎齡的胎兒中表達(dá)迅速升高，在出生前達(dá)到最高峰，此后緩慢下降，10歲時(shí)達(dá)到正常人水平，提示HCNP在海馬的發(fā)育中發(fā)揮重要的作用［7］。HCNP與 Alzheimer＇s病等認(rèn)知功能障礙的神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，體外內(nèi)側(cè)隔核神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，HCNP能夠提高乙酰膽堿（Acetycholine，ACh）的合成和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（Choline acetyl transferase，ChAT）的活性，并能與NGF一起促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元的分化［8］。然而HCNP在NSCs向神經(jīng)元或特定表型神經(jīng)元分化中起何作用，至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題主要研究海馬膽堿能神經(jīng)再生過(guò)程中HCNP對(duì)海馬齒狀回自體NSCs向膽堿能神經(jīng)元分化的促進(jìn)作用，為臨床應(yīng)用HCNP治療AD等認(rèn)知障礙疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，在NSCs培養(yǎng)液中加入HCNP后，NSCs向神經(jīng)元分化的比例明顯增加，且形成的神經(jīng)元突起也較空白對(duì)照組明顯豐富，提示HCNP能夠在一定程度上促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元的分化。此外，HCNP與切割穹窿海馬傘提取液聯(lián)合培養(yǎng)組與HCNP組以及空白組相比，神經(jīng)元胞體及突起數(shù)量、長(zhǎng)度均優(yōu)于HCNP組及空白對(duì)照組，其神經(jīng)元成熟度也明顯優(yōu)于其他兩組。本課題組以往的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，切割穹窿海馬傘提取液，能夠有效的促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs或者放射狀膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的分化，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在HCNP中加入切割穹窿海馬傘提取液后，其促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化的效果也較單純使用HCNP更為顯著，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示切割穹窿海馬傘提取液中存在某些能夠有效促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化的相關(guān)因子，需要進(jìn)一步深入研究。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們可知HCNP除能與NGF一起促進(jìn)神經(jīng)元向膽堿能表型的神經(jīng)元分化，還能有效的促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化。HCNP是一種小分子肽片段，且僅由11個(gè)氨基酸組成，與其他相關(guān)因子相比，體外人工合成較為方便，我們的研究為NSCs向神經(jīng)元定向分化的研究提供了新的思路，也為HCNP的臨床治療奠定了研究基礎(chǔ)。然而，HCNP在NSCs向神經(jīng)元定向分化中究竟如何發(fā)揮作用，以及HCNP是否也參與了源自NSCs的新生的不成熟神經(jīng)元向某些特定表型的成熟神經(jīng)元的分化，這些問(wèn)題仍然值得我們深入的研究。

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