西電集團(tuán)醫(yī)院（西安710077） 孫安志 溫紅俠 王曉輝

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P．a(chǎn)）是有引起有基礎(chǔ)病變患者社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院獲得性感染的重要條件致病菌。由于P．a(chǎn)易形成生物被膜（Biofilm，BF），因此該感染具有一定的難治性，且易轉(zhuǎn)化為慢性感染，并對(duì)危重患者造成了一定的生命威脅。已有多項(xiàng)資料研究證明14、15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素如紅霉素、阿奇霉素等可以抑制和破壞P．a(chǎn) BF的作用，阿奇霉素與其他有抗銅綠假單胞菌活性抗生素有協(xié)同作用。但亦有報(bào)道由于阿奇霉素的廣泛使用，導(dǎo)致多重耐藥菌株的產(chǎn)生［1］。但對(duì)紅霉素（Erythromycin，EM）長(zhǎng)期作用后BF內(nèi)P．a(chǎn)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究對(duì)EM在抑制BF形成的同時(shí)，是否影響B(tài)F內(nèi)P．a(chǎn)藥物敏感性進(jìn)行探討。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 將聚氯乙烯氣管導(dǎo)管（上海景年醫(yī)療器械有限公司）制成1cm×1cm，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌備用。

1．2 菌株：PAO1由丹麥哥本哈根大學(xué)臨床微生物科提供。質(zhì)控菌株為P．a(chǎn) ATCC 27853，由廣西醫(yī)科大學(xué)一附院臨床實(shí)驗(yàn)中心細(xì)菌室提供。

1．3 主要試劑：EM 標(biāo)準(zhǔn)粉劑（批號(hào)：130307－200215）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所。LB培養(yǎng)基和戊二醛（Sigma公司）。

2 研究方法

2．1 采用試管二倍稀釋法測(cè)定EM對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的最 低 抑 菌 濃 度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）：平行測(cè)定質(zhì)控菌株ATCC 27853的 MIC作質(zhì)量控制。

2．2 P．a(chǎn)BF模型的建立：采用文獻(xiàn)［2］方法并改良。將培養(yǎng)過(guò)夜的PA01，調(diào)至0．5麥?zhǔn)蠁挝唬儆蒙睇}水1∶200稀釋?zhuān)吭嚬芗尤?ml，每管置入滅菌BF載體1片，37℃培養(yǎng)24h后換液，以后每48h用50%LB換液。

2．3 抑制P．a(chǎn)生物膜形成實(shí)驗(yàn)：分為空白對(duì)照組、EM組。開(kāi)始建模時(shí)，加入藥物EM（1／8MIC）。于建模第7d采用連續(xù)稀釋法［2］法行活菌計(jì)數(shù)，并于第3d、第7d行生物膜半定量測(cè)定，每組2個(gè)標(biāo)本，每次測(cè)定均重復(fù)測(cè)定3次取平均值，另取分別1個(gè)標(biāo)本行SEM觀察，以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2．4 BF細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)：分別于建模3d和7d，生理鹽水沖洗去掉載體表面浮游菌，載體置于2ml生理鹽水，漩渦震蕩，取生物膜細(xì)菌，然后參照［3］采用Kirby－Bauer（K－B）紙片擴(kuò)散法行阿米卡星、美羅培南、哌拉西林、哌拉西林三唑坦、慶大霉素、舒普深、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶和氨曲南11種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)。

2．5 SEM觀察BF形成：滅菌生理鹽水沖洗去掉浮游菌后用2．5%戊二醛固定，pH7．4的PBS漂洗3次，依次用50%、70%、80%、90%、100%酒精脫水，真空條件下鍍金粉，SEM觀察。

2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS13．0，藥物抑制P．a(chǎn)形成BF作用的細(xì)菌數(shù)和各藥物組內(nèi)不同作用時(shí)間的細(xì)菌存活數(shù)比較用單因素方差分析；P．a(chǎn)早期或成熟BF經(jīng)藥物作用后BF內(nèi)細(xì)菌存活數(shù)比較用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析。

結(jié) 果

1 MIC EM 對(duì)P．a(chǎn)實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)控菌株ATCC 27853的 MIC均為128μg／ml。

2 抑制P．a(chǎn) BF形成實(shí)驗(yàn)

2．1 建模3d實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SEM觀察觀察，空白對(duì)照組可見(jiàn)均勻、密布堆積的稀薄生物膜，可見(jiàn)細(xì)菌輪廓及細(xì)菌間黏液樣物質(zhì)。EM組可見(jiàn)散在的早期BF，分布較空白對(duì)照組稀疏。EM組載體表面生物膜半定量和空白對(duì)照組比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有顯著性意義（P＜0．01）。提示EM組載體表面形成的生物膜少于空白對(duì)照組。

2．2 建模7d后實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SEM觀察，空白對(duì)照組載體表面可見(jiàn)濃厚黏液樣物質(zhì)，菌體輪廓模糊不清，BF呈立體結(jié)構(gòu)，而EM組僅見(jiàn)稀少的薄層生物膜。載體表面活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示EM組低于空白對(duì)照組（P＜0．01）。載體表面生物膜半定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EM組和空白對(duì)照組比較，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有顯著性（P＜0．01），提示EM組載體表面生物膜少于空白對(duì)照組。

3 EM對(duì)BF內(nèi)細(xì)菌藥敏影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)EM作用后，對(duì)所檢測(cè)的抗生素均敏感，但和空白對(duì)照組比較，對(duì)于早期BF細(xì)菌，環(huán)丙沙星抑菌圈增大（P＜0．05），頭孢他啶和氨曲南抑菌圈亦增大（P＜0．01），見(jiàn)表1。對(duì)于晚期BF細(xì)菌，頭孢吡肟、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星抑菌圈直徑明顯小于空白對(duì)照組（P＜0．01），而頭孢他啶組明顯增大（P＜0．05），見(jiàn)表2。

表1 紅霉素干預(yù)3d后生物膜細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表1 紅霉素干預(yù)3d后生物膜細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

注：△與空白對(duì)照組比較，P＜0．01，＊與空白對(duì)照組比較，P＜0．05

空白對(duì)照組（mm） 紅霉素組（mm）27．0±0．5 27．8±0．4美羅培南 27．1±0．6 27．3±0．7哌拉西林 29．1±0．8 28．9±0．6哌拉西林三唑坦 28．2±0．4 28．2±0．4慶大霉素 25．3±0．5 26．4±0．8舒普深 26．3±1．1 25．6±0．5頭孢吡肟 28．7±0．5 29．2±1．0左氧氟沙星 25．1±0．3 25．7±1．1環(huán)丙沙星 31．9±0．3 33．1±1．1＊頭孢他啶 27．4±0．5 28．3±0．5△氨曲南 24．3±0．5 26±0阿米卡星△

表2 紅霉素干預(yù)7d后生物膜細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表2 紅霉素干預(yù)7d后生物膜細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

注：△與空白對(duì)照組比較，P＜0．01，＊與空白對(duì)照組比較，P＜0．05

空白對(duì)照組（mm） 紅霉素組（mm）27．3±0．9 27．6±2．6氨曲南 24．2±0．2 26．3±2．6美羅培南 26．7±0．1 26．2±2．0哌拉西林 28．6±1．9 29．4±1．0哌拉西林三唑坦 28．3±1．6 29．6±1．0慶大霉素 25．9±0．8 27．3±2．4舒普深 26．6±0．9 26．8±1．6頭孢吡肟 28．2±0．7 23．8±0．7△頭孢他啶 27．6±1．1 28．9±0．8＊環(huán)丙沙星 31．6±0．9 26．5±1．1△左氧氟沙星 24．6±1．0 18．8±1．2阿米卡星△

討 論

BF是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境、有利于生存而特有的生命現(xiàn)象，系指細(xì)菌吸附于惰性物體如生物醫(yī)學(xué)材料或機(jī)體黏膜表面后，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白復(fù)合物，形成網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌相互粘連并將其自身克隆聚集纏繞其中形成的膜樣物。BF的形成和發(fā)展大致經(jīng)歷了粘附期、種殖期、生長(zhǎng)期、成熟期、播散期幾個(gè)時(shí)期。成熟的P．a(chǎn)生物膜由蘑菇樣或柱樣亞單位組成，每個(gè)亞單位又互相交錯(cuò)成網(wǎng)狀，菌體之間互相粘連附著于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的表面，外層系碳?xì)浠衔锉荒?。P．a(chǎn)生物被膜這種特殊結(jié)構(gòu)，堅(jiān)實(shí)、穩(wěn)定，作為一保護(hù)屏障，不易被破壞，保護(hù)細(xì)菌避免與抗生素和免疫攻擊物接觸。有報(bào)道［4］顯示，由于細(xì)菌生物膜的立體結(jié)構(gòu)，形成一定的滲透屏障，延緩了抗生素對(duì)BF的滲透。

目前研究顯示十四（EM、羅紅霉素、克拉酶素）、十五元環(huán)（阿奇霉素）的大環(huán)內(nèi)酯抗生素能抑制藻酸鹽合成的關(guān)鍵酶－GMD的活性，顯著減少藻酸鹽的合成，抑制BF的形成，臨床實(shí)踐也證實(shí)［5］：低劑量紅霉素能改善支氣管擴(kuò)張并銅綠簡(jiǎn)單胞菌生物膜感染患者肺功能的急性加重的次數(shù)，但可能增加對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的耐藥性。但是對(duì)于其他抗生素的敏感性尚無(wú)報(bào)道。

本研究顯示，在EM作用3d時(shí)，SEM觀察發(fā)現(xiàn)載體表面僅形成散在、稀疏的早期BF，而空白對(duì)照組可見(jiàn)均勻、密布堆積的稀薄生物膜，可見(jiàn)細(xì)菌輪廓及細(xì)菌間黏液樣物質(zhì)。BF半定量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，EM組明顯少于空白對(duì)照組。EM作用7d后，EM組載體表面僅見(jiàn)稀少的薄層生物膜，而空白對(duì)照組載體表面可見(jiàn)濃厚黏液樣物質(zhì)，菌體輪廓模糊不清，BF呈立體結(jié)構(gòu)。載體表面活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示EM組低于空白對(duì)照組。載體表面生物膜半定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EM組載體表面生物膜少于空白對(duì)照組。以上研究結(jié)果顯示，1／8MICEM可以抑制P．a(chǎn)生物膜的形成。

另有多項(xiàng)研究顯示［6，7］，亞抑菌濃度抗生素長(zhǎng)期連續(xù)作用于P．a(chǎn)后，可誘發(fā)細(xì)菌耐藥和交叉耐藥產(chǎn)生。但是，目前尚未見(jiàn)到，關(guān)于長(zhǎng)期連續(xù)使用亞抑菌濃度的EM對(duì)BF內(nèi)P．a(chǎn)抗生素敏感性影響的相關(guān)報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)就1／8MICEM連續(xù)作用3d和7d，在抑制P．a(chǎn)生物膜形成同時(shí)，是否會(huì)影響頭孢他啶、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和氨曲南等11種抗生素對(duì)BF內(nèi)P．a(chǎn)的敏感度進(jìn)行探討。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］，不論是早期還是晚期BF，空白對(duì)照組P．a(chǎn)對(duì)所檢測(cè)的抗生素均敏感。單獨(dú)應(yīng)用敏感抗生素并不能完全清除BF內(nèi)P．a(chǎn)，但是和能破壞BF的EM聯(lián)合使用后，卻產(chǎn)生良好的協(xié)同殺菌作用，該結(jié)果提示，BF對(duì)抗生素的滲透限制在細(xì)菌耐藥方面有著重要的作用。

EM作用3d后，和空白對(duì)照組比較，對(duì)于早期BF細(xì)菌，環(huán)丙沙星抑菌圈直徑增大，頭孢他啶和氨曲南抑菌圈直徑亦增大，其他抗生素抑菌圈直徑大小無(wú)差異。但隨著EM連續(xù)作用時(shí)間延長(zhǎng)至7d時(shí)，盡管頭孢吡肟、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星依然對(duì)P．a(chǎn)敏感，但是所形成的抑菌圈直徑卻明顯小于空白對(duì)照組。同時(shí)觀察不同藥物作用時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中環(huán)丙沙星抑菌圈直徑由EM作用3d時(shí)的33．1±1．1mm，降低至作用7d時(shí)的26．5±1．1mm，左氧氟沙星抑菌圈直徑由EM作用3d時(shí)的25．7±1．1mm，降低至作用7d時(shí)的18．8±1．2mm，頭孢吡肟抑菌圈直徑由EM作用3d時(shí)的29．2±1．0mm，降低至作用7d時(shí)的23．8±0．7mm。提示隨著1／8MICEM作用時(shí)間的延長(zhǎng)，環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和頭孢吡肟對(duì)P．a(chǎn)的敏感性呈下降趨勢(shì)，并且以左氧氟沙星顯著，甚至臨近敏感標(biāo)準(zhǔn)（18mm）。但是頭孢他啶抑菌圈直徑較空白對(duì)照組明顯增大，觀察EM作用不同時(shí)間點(diǎn)抑菌圈的大小發(fā)現(xiàn)，頭孢他啶抑菌圈直徑由EM作用3d時(shí)的28．3±0．5mm，增大至作用7d時(shí)的28．9±0．8mm，盡管兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍有一定的增大趨勢(shì)。

經(jīng)分析以上結(jié)果顯示，亞抑菌濃度EM可以抑制早期和晚期P．a(chǎn)生物膜形成的同時(shí)，隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，EM使頭孢他啶對(duì)P．a(chǎn)的抑菌圈有增大趨勢(shì)，但卻使環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和頭孢吡肟對(duì)P．a(chǎn)的敏感性呈下降趨勢(shì)，并且以左氧氟沙星顯著，甚至臨近敏感標(biāo)準(zhǔn)（18mm）。

［1］ Lutz L，Pereira DC，Paiva RM，et al．Macrolides decrease the minimal inhibitory concentration of anti－pseudomonal agents againstPseudomonas aeruginosa from cystic fibrosis patients in biofilm［J］．BMC Microbiol，2012 ，8（12）：196．

［2］ Dong YH，Wang LH，Xu JL，et al．Quenching quorumsensing dependent bacterial infection by an N－acyl homoserine lactonase［J］．Nature，2001，411：813－817．

［3］ Brooun A，Uu SH，Lewis K．A dose－response study of antibiotic in Pseudomonas aeruginoda biofilms［J］．Antimicrob A．Gents Chemother，2000，44：640－646．

［4］ Wlters MC，Roe F，Bugnicout A，et al．Contributions of antibiotic penetration，oxygen limitation，and low metabolic activity to toleran ce of Pseudomonas aeruginosa biofilms to ciprofloxacin and tobramycin［J］．Antimicrob A－gents Chemother，2003，47：317－323．

［5］ Serisier DJ，Martin ML，Mc Guckin MA ，et al．Effect of long－term，low－dose erythromycin on pulmonary exacerbations among patients with non－cystic fibrosis bronchiectasis：the BLESS randomized controlled trial［J］．JAMA，2013，309（12）：1260－1267．

［6］ 楊敬芳，郭 進(jìn)．環(huán)丙沙星次抑菌濃度誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥的實(shí)驗(yàn)研究［J］．中國(guó)藥師，2002，5（1）：11－13．

［7］ 陳 瑞，唐英春，朱家馨，等．亞抑菌濃度亞胺培南體外誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15（2）：131－133．