劉繼超，姜鐵民，劉 豐，岳 華，張咚咚，陳歷俊

(北京三元食品股份有限公司，北京100163)

金黃色葡萄球菌是引起人類感染和食物中毒最常見的病原菌之一，其分泌的腸毒素則是引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要原因，根據(jù)其血清學(xué)特性，可分為 5 型(SEA、SEB、SEC、SED 和 SEE)［1-2］，腸毒素D(SED)基因位于質(zhì)粒上［3］，是引起食物中毒事件中常見腸毒素之一，因此靈敏、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)腸毒素方法成為研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)腸毒素檢測(cè)方法主要有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和免疫學(xué)方法，易產(chǎn)生假陽(yáng)性，特異性不強(qiáng)［4-5］。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，熒光定量PCR技術(shù)在食品、疾控等檢測(cè)領(lǐng)域中扮演越來(lái)越重要的角色，例如劉生峰等利用TaqMan探針熒光PCR建立腸出血性大腸埃希菌O157∶H7的檢測(cè)方法［6］。該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)和實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)，又可克服現(xiàn)有免疫學(xué)檢測(cè)方法(如ELISA)不足，并且已成功應(yīng)用于食品中致病菌的檢測(cè)［7］。

本研究以快速篩查金黃色葡萄球菌腸毒素D為目的，建立了一種快速定量、靈敏、特異地檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素D的TaqMan探針熒光定量PCR方法，對(duì)保障乳制品的安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌腸毒素A(ATCC-13565)、金黃色葡萄球菌腸毒素B(ATCC-14458)、金黃色葡萄球菌腸毒素C(ATCC-19095)、金黃色葡萄球菌腸毒素D(ATCC-23235)、金黃色葡萄球菌腸毒素E(ATCC-27664)、金黃色葡萄球菌腸毒素H(ATCC-51811)、單增李斯特菌(ATCC-15313)、大腸桿菌(ATCC-25922)、金黃色葡萄球菌(CGMCC-1.0128)、沙門氏菌(CGMCC-1.1552)以及表皮葡萄球菌(CGMCC-1.2429)分別購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所菌種保藏中心、中國(guó)微生物菌種保藏中心、中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所和美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。

表1 金黃色葡萄球菌腸毒素D的引物與探針Table 1 Oligonucleotide primers sequences and probe of SED

熒光定量PCR擴(kuò)增儀7500 美國(guó)ABI公司;熒光定量PCR反應(yīng)體系中各試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，原料乳樣品來(lái)自三元牛場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物和探針設(shè)計(jì) 從Genebank公布的核酸序列庫(kù)中篩選SEA基因保守片段，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物和探針，其序列如表2，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 模板DNA的提取 使用培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行金黃色葡萄球菌腸毒素D基因組DNA的提取，提取菌體DNA方法見參考文獻(xiàn)［8-9］。

1.2.3 反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù) 本實(shí)驗(yàn)所采用的熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL，分別為:Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL，上下游兩個(gè)引物(10μmol)各0.4μL，探針0.8μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.2μL，模板DNA 2μL，加水至 20μL。Applied Biosystems7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀反應(yīng)參數(shù):95℃變性30s，以95℃5s，60℃ 34s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在60℃結(jié)束開始收集熒光信號(hào)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備 以金黃色葡萄球菌腸毒素D菌株的基因組為模板，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的基因片段。反應(yīng)體系為:模板1μL，上游引物0.5μL(25μmol/L)，下游引物 0.5μL(25μmol/L)，10× 擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液 2μL，PCR 染料 2μL，dNTPs 0.5μL，Taq DNA 聚合酶 0.5μL，無(wú)菌超純水 13μL，總體積為20μL，離心混勻后置PCR儀上進(jìn)行自動(dòng)化擴(kuò)增反應(yīng)，循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性3min，95℃變性30s，55℃退火 30s，72℃ 延伸 1min，共 35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳，TaKaRa瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收條帶，連接到pGM19-T載體上，并導(dǎo)入到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)過夜，進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑取陽(yáng)性克隆，由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證［10］。采用質(zhì)粒試劑盒抽提重組質(zhì)粒，按一定倍數(shù)稀釋后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)260nm下的OD值，計(jì)算其拷貝數(shù)(copies/mL)。拷貝數(shù)=50(g/mL)×10-6×OD×6.02×1023/660(g)×擴(kuò)增堿基數(shù)。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及靈敏度的確定 將制備的標(biāo)準(zhǔn)模板，按10倍遞增稀釋，分別用本實(shí)驗(yàn)建立的熒光定量PCR檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，以模板的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定其靈敏度。

1.2.6 特異性實(shí)驗(yàn)分析 以大腸桿菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌以及腸毒素A、B、C、E、H為對(duì)照菌，利用上述所建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行特異性驗(yàn)證。

1.2.7 人工污染模擬檢測(cè) 將金黃色葡萄球腸毒素D菌液人工污染于乳中，使用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度的稀釋，根據(jù)平板計(jì)數(shù)選取3個(gè)稀釋梯度，提取不同濃度乳中金黃色葡萄球菌的DNA，再將提取的DNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，確定本檢測(cè)方法應(yīng)用于乳中檢測(cè)的下限，對(duì)靈敏性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的制備

對(duì)SED引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增目的片段進(jìn)行切膠后(圖1)，利用TaKaRa瓊脂凝膠提取試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行回收，以回收的目的片段為模板進(jìn)行克隆，進(jìn)行藍(lán)白篩選，液體培養(yǎng)提取質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果證明擴(kuò)增片段與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列完全相符。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的質(zhì)粒稀釋400倍后在260nm下的吸光值為0.2347，經(jīng)計(jì)算后其拷貝數(shù)為4.0×1012copies/mL。

圖1 PCR擴(kuò)增SED的結(jié)果Fig.1 Results of PCR amplification of SED

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度的確定

將標(biāo)準(zhǔn)模板按10倍依次稀釋，采用本實(shí)驗(yàn)所建立的熒光定量PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，以各標(biāo)準(zhǔn)模板的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 2，y=-4.207x+36.429，R2=0.999，擴(kuò)增效率為96.052%，得出該方法的靈敏度為40copies/mL。

圖2 SED標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Amplification plots corresponding to standard curves

2.3 特異性分析

以不同菌株基因組模板進(jìn)行熒光定量分析，結(jié)果顯示只有金黃色葡萄球菌腸毒素D基因組模板有典型的熒光擴(kuò)增曲線，大腸桿菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌以及腸毒素A、B、C、E、H與陰性對(duì)照均無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，如圖3所示，表明該法檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素D具有良好的特異性。

圖3 特異性分析結(jié)果圖Fig.3 Specificity analysis of the real-time PCR

2.4 模擬檢測(cè)結(jié)果分析

使用1.2.7的方法選取稀釋度為10-6和10-7的稀釋梯度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，稀釋度10-6為107個(gè)菌落、稀釋度10-7為10菌落。按1.2.2提取方法分別提取不同梯度濃度乳中金黃色葡萄球菌腸毒素D菌的DNA，作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖4，表明1.0×103、1.0 ×102CFU/mL 均為有效擴(kuò)增，所以判定本方法檢測(cè)乳中金黃色葡萄球菌腸毒素D菌的靈敏度為1.0×102CFU/mL。

3 結(jié)論與討論

本研究建立的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素D具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)人工染菌的乳品樣品的檢測(cè)表明，該方法在檢測(cè)乳品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的污染方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)保障乳制品的質(zhì)量安全具有重要意義，在應(yīng)對(duì)細(xì)菌性食物中毒等突發(fā)公共衛(wèi)生事件中具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖4 TaqMan探針法檢測(cè)乳中金黃色葡萄球菌腸毒素D菌的靈敏度Fig.4 TaqMan probe sensitivity tests of SED in milk samples

目前，食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法主要依靠細(xì)菌分離、培養(yǎng)和鑒定，該方法雖然準(zhǔn)確，但存在耗時(shí)長(zhǎng)、成本高及靈敏度低等問題［11］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的PCR方法給整個(gè)生物檢測(cè)帶來(lái)了新希望，以標(biāo)記特異性熒光探針為特點(diǎn)的熒光定量PCR技術(shù)，實(shí)行完全閉管式操作，不僅能大大減少擴(kuò)增產(chǎn)物的污染機(jī)會(huì)，提高檢測(cè)的特異性，且可通過計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確定量提高檢測(cè)的靈敏度，完全克服了普通PCR的缺點(diǎn)［12］，而且這種方法操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間，適用于大樣本量的篩查［13］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素D的方法具有極強(qiáng)特異性，以標(biāo)準(zhǔn)模板的拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=-4.207x+36.429，R2=0.999，擴(kuò)增效率為96.052，得出該方法的靈敏度為40copies/mL，檢測(cè)乳中金黃色葡萄球菌腸毒素D菌的靈敏度為1.0×102CFU/mL，表明本研究建立的金黃色葡萄球菌腸毒素D的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。該方法在檢測(cè)乳品中金黃色葡萄球菌腸毒素D的污染方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)保障乳制品的質(zhì)量安全方面具有重要意義。

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