曹鳳波，王曉明，周 晶，李媛媛，劉 賓，霍貴成

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

發(fā)酵乳制品中的益生菌不僅可以改善食品的品質(zhì)，其自身也為人體提供改善腸道功能、促進(jìn)物質(zhì)吸收等有益作用。酸奶是最為普遍的一種利用乳酸菌發(fā)酵的乳制品，其主要以德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌為發(fā)酵劑，在42℃下發(fā)酵至pH4．5，低溫下儲存、運輸和銷售［1］。在發(fā)酵后和食用前的過程中，乳酸菌仍能繼續(xù)繁殖和發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸，使pH進(jìn)一步下降，產(chǎn)生人們無法接受的過酸味，同時因為酸度過高使菌體大量死亡，活菌數(shù)目較少，降低益生作用，這就是后酸化。

保加利亞乳桿菌是引起后酸化的主要菌株，因為其產(chǎn)酸和適應(yīng)酸的能力較嗜熱鏈球菌更強［2］。為了解決酸奶后酸化問題，人們曾嘗試改善生產(chǎn)工藝和儲藏等方法，或通過基因誘變得到后酸化能力弱的突變株，但都存在著一定的弊端且無法根本解決這一問題。作為物產(chǎn)大國，我國微生物資源同樣十分豐富，通過篩選得到發(fā)酵性能好，低溫下產(chǎn)酸能力低的野生型菌株顯得尤為重要。本實驗通過對乳品重點實驗室保存的保加利亞乳桿菌進(jìn)行篩選，得到兩株后酸化能力最弱的菌株，在已清楚其后酸化弱的機理的情況下，就產(chǎn)酸特性、后酸化特性、產(chǎn)香特性、質(zhì)構(gòu)特性等能決定酸奶品質(zhì)高低的重要發(fā)酵性能指標(biāo)進(jìn)行測定［3］，以驗證其是否能夠作為潛在的發(fā)酵劑進(jìn)行深入的研究，為大規(guī)模投入生產(chǎn)做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種:從乳品科學(xué)教育部重點實驗室菌種保藏中心(KLDS-DICC)篩選出的兩株弱后酸化保加利亞乳桿菌 KLDS1．1011、KLDS1．1006［3］和具有優(yōu)良發(fā)酵性能的對照菌 KLDS1．9201［4］。

培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基;11%(w/v)脫脂乳培養(yǎng)基。

主 要 試 劑:1% NaHSO3，1mol/LNaHCO3，0．01mol/L(1/2 I2)，鄰苯二胺，4mol/L HCl，濃硫酸，苯酚，三氯乙酸，0．1mol/L NaOH，酚酞等，所有試劑均為分析純。

主要儀器:Delta320精密pH計 Mettler Toledo公司;DU-800紫外分光光度計 Beckman公司;GL-21M高速冷凍離心機、BCN1360型生物潔凈工作臺、SPX-150B生化培養(yǎng)箱、HIRAYAMA HVE-50形高壓滅菌器、TA．XT-2i型質(zhì)構(gòu)儀等。

1.2 實驗方法

1．2．1 菌株產(chǎn)酸性能的測定 將培養(yǎng)16h的菌株按5．0×106cfu/mL的接種量轉(zhuǎn)接到11%(w/v)的脫脂乳中，42℃發(fā)酵至 pH4．5左右，分別在 4、20℃儲藏，以供后面實驗使用。

1．2．1．1 發(fā)酵期間產(chǎn)酸能力測定 自發(fā)酵開始，每隔2h測定乳樣的pH，共測定到第12h。

1．2．1．2 儲藏期間后酸化程度的測定 分別測定4℃和20℃條件下儲藏1、2、7、14和21d發(fā)酵乳的滴定酸度和pH。滴定酸度的測定方法參照GB5413．34-2010，pH測定方法采用 Delta320精密 pH計直接測定。

1．2．2 菌株產(chǎn)香性能的測定 取發(fā)酵 0、6、12、18、24、48h 及7、14、21d 的待測乳樣 60mL，加等體積的16%三氯乙酸溶液，混勻，8000r/min離心10min，取上清液用濾紙過濾，以保證澄清，得到的濾液備用。以未接菌的脫脂乳作為對照。

1．2．2．1 乙醛含量的測定 酸奶中的乙醛在酸性條件下與1%的亞硫酸氫鈉發(fā)生加成反應(yīng)，剩余的亞硫酸氫鈉被碘氧化;在堿性條件下乙醛亞硫酸氫鈉與0．01mol/L的碘標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的當(dāng)量關(guān)系計算乙醛含量［5］。每組樣品至少測定 3次，取平均值。

1．2．2．2 雙乙酰含量的測定 鄰苯二胺和雙乙?？梢苑磻?yīng)生成2，3-二甲基并吡嗪，其鹽酸鹽在335nm下有最大吸收值，可對雙乙酰進(jìn)行定量測定［5］。每組樣品至少測定3次，取平均值。

1．2．3 菌株發(fā)酵酸乳的物性特性的測定

1．2．3．1 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的測定 采用TPA質(zhì)地剖面分析法，利用TA．XT-2i型質(zhì)構(gòu)儀將4℃儲存7d的發(fā)酵乳進(jìn)行質(zhì)構(gòu)的測定，每個樣品重復(fù)測定3次。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)設(shè)定:探頭類型P/35mm，下降速度2．0mm/s，測試速度 5．0mm/s，回程速度 5．0mm/s，間隔時間10s，下壓變形距離10mm，感應(yīng)力Auto-5g。

1．2．3．2 脫水收縮能力的測定 將4℃ 儲存7d的酸乳在凝固狀態(tài)下輕輕地收集表面析出的所有乳清，與酸奶的總體積比的百分?jǐn)?shù)就是脫水收縮程度［6］。每個樣品做3個平行樣。

1．2．4 統(tǒng)計分析 采用SPSS19．0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(p＜0．05)，每組重復(fù)3次，最終結(jié)果表示方式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。相同字母代表差異性不顯著，不同字母代表差異性顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸特性

在工業(yè)生產(chǎn)中，產(chǎn)酸能力是篩選乳酸菌發(fā)酵劑的一個重要指標(biāo)，但是前期產(chǎn)酸能力高也意味著在低溫條件同樣會較快的繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酸，導(dǎo)致嚴(yán)重的后酸化，所以在篩選弱后酸化發(fā)酵劑時產(chǎn)酸并不是一個決定性指標(biāo)。在42℃下發(fā)酵脫脂乳的過程中，KLDS1．1011 和 KLDS1．1006 的產(chǎn)酸量始終都顯著低于對照菌 KLDS1．9201(p＜0．05)，并且在 pH 達(dá)到4．5 后沒有過多的下降，而 KLDS1．9201 在到達(dá) pH4．5以后仍快速產(chǎn)酸，在42℃條件下發(fā)酵到12h時，pH已降至3．89。乳酸菌的產(chǎn)酸曲線和生長曲線趨勢相一致，在發(fā)酵初期，乳酸菌處于延滯期，生長較為緩慢，因而產(chǎn)酸速率也很低，當(dāng)進(jìn)入對數(shù)生長期時，乳酸菌生長加快，同時產(chǎn)酸速率也加快，處于穩(wěn)定期后，雖然乳酸菌仍在生長，但由于受到自身代謝產(chǎn)物的影響，尤其是酸度的影響，菌株產(chǎn)酸速率逐漸下降，達(dá)到一個較恒定的值［7］。針對 KLDS1．9201 本實驗室已經(jīng)對其做過大量研究，分批發(fā)酵取得較好的成果［4］。通過與其對比，可以更好的評價兩株實驗菌的性能。本實驗中KLDS1．1011和KLDS1．1006這兩株菌在達(dá)到穩(wěn)定后產(chǎn)酸量仍然很低，在低pH環(huán)境下適應(yīng)能力較差，表明其對酸比對照菌要敏感，且KLDS1．1011更為敏感，這一特性正是酸奶低溫儲藏時降低后酸化程度的一個前提。

圖1 單菌株發(fā)酵的pH變化Fig．1 Acid-producing activities of the strains

2.2 菌株在儲藏期間的后酸化特性

實驗菌和對照菌分別在4℃和20℃下儲藏21d，測定發(fā)酵乳的滴定酸度和pH，以評價其后酸化程度(如表 1、表 2)。實驗發(fā)現(xiàn)，在 4℃ 下第 2d時，KLDS1．9201已明顯的產(chǎn)酸，酸度升高了 18．57%，pH 下降到 4．24，而 KLDS1．1006 和 KLDS1．1011 發(fā)酵的酸乳酸度分別升高了9．59%和5．56%。到第21d，KLDS1．9201 的酸度已經(jīng)升高了 51．95%，pH 下降到 3．67。KLDS1．011 和 KLDS1．1006 也有不同程度的產(chǎn)酸，但顯著弱于對照菌(p＜0．05)，在第21d，兩株菌的pH為4．25和4．17。因此，該兩株實驗菌在貨架期間有較低的產(chǎn)酸速率，有效延緩了后酸化的發(fā)生。

表1 酸奶在4℃下儲存的pH和酸度變化Table 1 Changes in acidity and pH of yogurt during storage at 4℃

表2 酸奶在20℃下儲存的pH和酸度變化Table 2 Changes in acidity and pH of yogurt during storage at 20℃

圖2 儲存期間雙乙酰含量的變化Fig．2 The changes in diacetyl contents during storage

在20℃條件下儲存，保加利亞乳桿菌的代謝速率較高，產(chǎn)酸能力顯著高于4℃下的產(chǎn)酸情況(p＜0．05)。在儲藏第 7d，KLDS1．9201 的滴定酸度已經(jīng)增加了 38．89%，到第 21d，其 pH 下降到 2．99，發(fā)生嚴(yán)重的后酸化。雖然 KLDS1．1011和 KLDS1．1006兩株菌隨冷藏時間延長產(chǎn)酸程度有所加強，但仍顯著低于對照菌(p ＜ 0．05)，在第 21d，酸度分別增加了40．28%和49．32%。我國多數(shù)消費者習(xí)慣于在常溫下儲藏酸奶，20℃下，酸奶發(fā)生后酸化的程度直接影響了食用時的品質(zhì)［8］。KLDS1．1006受溫度的影響較大，后 酸 化 程度 強 于 KLDS1．1011(p ＜ 0．05)，故KLDS1．1011的后酸化能力更弱，適合作為弱后酸化的發(fā)酵劑進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

導(dǎo)致 KLDS1．1011 和 KLDS1．1006 后酸化能力較低的原因是在乳酸菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸過程中有幾種重要的酶參與其中，其中對后酸化程度起到關(guān)鍵性作用的酶是H+-ATPase和乳酸脫氫酶，通過實驗證明，這兩株菌的H+-ATPase和乳酸脫氫酶的活性較低，決定了其較弱的后酸化能力［9］。

2.3 菌株在冷藏期間的產(chǎn)香特性

乳酸菌在糖的代謝過程中可以產(chǎn)生多種揮發(fā)性芳香化合物，如乙醛、丙酮、乙偶姻、雙乙酰、乙醇等，它們與有機酸相互作用，形成酸乳的獨特風(fēng)味，其中乙醛和雙乙酰是風(fēng)味物質(zhì)的主要成分［10］，所以在篩選優(yōu)良發(fā)酵菌種時，往往把這兩個指標(biāo)作為測定的項目。如圖2所示，在4℃冷藏過程中，三株菌產(chǎn)雙乙酰的能力強弱分別是KLDS1．9201＞KLDS1．1011＞KLDS1．1006，并且 KLDS1．1006 較其他兩株菌的產(chǎn)量差距較大(p＜0．05)。在第18h時，三株菌都達(dá)到了最大量，KLDS1．9201 的雙乙酰濃度是 13．05μg/mL，KLDS1．1011 和 KLDS1．1006 分別是 12．23μg/mL 和5．00μg/mL。有報道稱［11］，雙乙酰的最佳收獲時間是12～24h，本實驗結(jié)果與其結(jié)論相一致。然而三株菌達(dá)到產(chǎn)乙醛最大量的時間卻不同，KLDS1．9201和KLDS1．1011在 24h時達(dá)到最大量，濃度分別是31．18μg/mL 和25．12μg/mL，KLDS1．1006 在18h 達(dá)到26．86μg/mL的最大產(chǎn)量(圖3)。酸奶發(fā)酵劑的菌種對乙醛產(chǎn)量有很大的影響［12］，李勇等人［13］的實驗證明乙醛的產(chǎn)生與酸度有顯著的正相關(guān)，在本實驗中，KLDS1．9201、KLDS1．1006 和 KLDS1．1011 的產(chǎn)酸能力依次遞減，乙醛的產(chǎn)量也呈顯著下降趨勢(r=0．992，p＜0．05)，這同樣證明了他們的觀點。在前24h內(nèi)，乙醛的產(chǎn)生基本是逐漸增加的，達(dá)到最大量后又較緩的下降。乙醛濃度的降低一方面是由于發(fā)酵劑菌種產(chǎn)生了乙醇脫氫酶，將乙醛降解成乙醇，另一方面是由于儲藏過程中揮發(fā)了一部分［14］。在此處，仍然是 KLDS1．9201 產(chǎn) 乙 醛 的 能 力 最 大，KLDS1．1011雖然比KLDS1．1006的產(chǎn)量低，但是差異不顯著(p ＞0．05)。

表3 三株保加利亞乳桿菌所得酸乳的TPA質(zhì)構(gòu)分析Table 3 TPA analysis of yogurt fermented by 3 strains of Lactobacillus Bulgaricus

圖3 儲存期間乙醛含量的變化Fig．3 The changes of acetaldehyde contents during storage

2.4 冷藏過程中不同菌株發(fā)酵酸乳的物性特性

酸乳由于脫水收縮而在其表面形成乳清，導(dǎo)致外觀和口感品質(zhì)下降［15］。在表 3 中，KLDS1．1011 發(fā)酵酸乳析出的乳清體積只占總體積的2．98%，凝乳狀態(tài)較好，KLDS1．1006 和 KLDS1．9201 的脫水收縮率分別是 4．12% 和 8．43%，析出乳清較多(p ＜ 0．05)。乳清的析出是由于在凝乳過程中構(gòu)成膠體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的顆粒進(jìn)行重新排列，它受不同流變學(xué)參數(shù)的影響［16］。Folkenberg 等人［17］發(fā)現(xiàn)脫水收縮與酸奶的硬度呈負(fù)相關(guān)，與黏度呈正相關(guān)。在本實驗中，KLDS1．1011 的 硬 度 大 于 KLDS1．1006 和 對 照 菌KLDS1．9201，呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)(r=-0．998，p ＜0．05)，但是黏性相關(guān)性不顯著(r=0．754，p ＞ 0．05)。內(nèi)聚性最小的是KLDS1．1006，與其他指標(biāo)不具相關(guān)性，但是 KLDS1．1011 的內(nèi)聚性是0．424，依然是最高。攪拌前，酸奶的硬度大小是其凝膠結(jié)構(gòu)的一個特征，是酸奶中多種化學(xué)鍵的結(jié)合及可溶性微粒聚合的結(jié)果。不同發(fā)酵劑生產(chǎn)的酸奶硬度有時會有較大差別，酸奶質(zhì)地較軟，不利于儲存及運輸，對品質(zhì)有較大影響。黏度也是酸奶品質(zhì)的重要參數(shù)，大量實驗表明復(fù)合發(fā)酵酸奶的黏度要大于單菌株發(fā)酵，并且嗜熱鏈球菌可明顯增強產(chǎn)品的黏性。綜合各物性指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，實驗菌株KLDS1．1011的性能更好。

3 結(jié)論

KLDS1．9201是生長速度快、代謝強、產(chǎn)酸速率快的優(yōu)良發(fā)酵酸乳菌株，通過將實驗菌株與此菌各項發(fā)酵性能對比發(fā)現(xiàn)，KLDS1．1011 和 KLDS1．1006 雖然產(chǎn)酸能力略低，但根據(jù)GB19302-2010對酸乳制品的酸度大于70°T的要求，這兩株菌滿足了發(fā)酵劑菌種的基本要求，而且在酸奶批量生產(chǎn)時可以與嗜熱鏈球菌搭配，提高前期產(chǎn)酸速率。另外，在4℃冷藏期間兩株菌后酸化程度很弱，發(fā)酵的酸奶質(zhì)構(gòu)較好，具有開發(fā)成乳制品發(fā)酵劑的潛力。但是，在20℃儲藏期間，KLDS1．1006發(fā)生的后酸化程度較大，發(fā)酵的酸乳硬度偏低，性能不及 KLDS1．1011，故 KLDS1．1011的綜合性能更好，對此菌進(jìn)行深入研究的價值更大。

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