黃阿三　林森　楊建云等

[摘 要] 目的：通過破壞試驗(yàn)（強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化）考察建立高效液相色譜法的專屬性；研究影響因素試驗(yàn)（高溫、高濕、光照）中DHEA衍生物的外觀性狀、有關(guān)物質(zhì)及含量的變化，初步考察其穩(wěn)定性。方法：利用高效液相色譜法，通過與對(duì)照品比較，觀察變化情況。結(jié)果：在高溫和光照條件下，DHEA衍生物都比較穩(wěn)定；在高濕條件下，雖然性狀仍為白色粉末，但其含量會(huì)有所降低，只有99.4%。結(jié)論：DHEA衍生物在所有考察條件中均很穩(wěn)定，但會(huì)引濕增重，故保存過程中應(yīng)注意防潮。

[關(guān)鍵詞] DHEA衍生物；高效液相色譜法；破壞試驗(yàn)；影響因素試驗(yàn)；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)： o623.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：2095-5200（2014）06-062-03

DHEA衍生物（derivative of DHEA，化學(xué)名為5β-雄甾烷-3α，17β-二醇）是一種具有合成作用的睪酮前體類固醇藥物，為天然的腎上腺皮質(zhì)激素類，具有抗糖皮質(zhì)激素活性的作用。人體肝臟里有一種3β-羥基類固醇脫氫酶可以把它轉(zhuǎn)化為睪酮，因此它是一步轉(zhuǎn)化，不經(jīng)中間體代謝。且有實(shí)驗(yàn)證明DHEA衍生物的免疫調(diào)節(jié)作用，具有顯著增加循環(huán)嗜中性粒細(xì)胞、血小板和NK細(xì)胞的功能[1-4]。由于DHEA衍生物與人體的生理活動(dòng)密切相關(guān)，因此，需增加對(duì)DHEA衍生物的了解，以便更好地發(fā)揮DHEA衍生物的生理學(xué)作用、減小或消除DHEA衍生物的生理學(xué)危害。

本課題組建立了DHEA衍生物的RP-HPLC的檢測(cè)方法，成功地將其與有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了分離，建立了工作曲線，檢測(cè)限低至33ng。但是，對(duì)于DHEA衍生物穩(wěn)定性的研究卻未見報(bào)道[5]，而DHEA衍生物的穩(wěn)定性對(duì)高效發(fā)揮其藥用作用有重要指導(dǎo)意義。因此，本文主要開展關(guān)于討論DHEA穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)。

本文預(yù)期通過酸、堿、氧化破壞試驗(yàn)引起DHEA衍生物的降解，應(yīng)用所建立的RP-HPLC方法檢測(cè)降解后的物質(zhì)，得到破壞試驗(yàn)后DHEA衍生物的含量信息，從而獲知酸、堿、氧化破壞試驗(yàn)對(duì)DHEA衍生物穩(wěn)定性的影響，為藥物可能的降解途徑和降解機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為進(jìn)一步探討DHEA衍生物的固有穩(wěn)定性，并了解影響其穩(wěn)定性因素，進(jìn)行了DHEA衍生物的影響因素（溫度、濕度、光線）試驗(yàn)，通過HPLC法分析其含量、性狀和有關(guān)物質(zhì)隨時(shí)間的變化，為制劑生產(chǎn)工藝、包裝、貯存條件和建立降解產(chǎn)物分析方法提供依據(jù)。本法方便、快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、精密，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和藥品

Waters 600-717-996 型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，美國）；電子分析天平（Sartorius，BP211D）；恒溫水浴鍋（B-260，上海亞榮生化儀器廠）；真空超聲波清洗儀（KQ-6030，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；色譜柱：Diamonsil C18（4.6mm×250mm，5μm）；乙腈（色譜純，禹王試劑）；水（娃哈哈純凈水）；鹽酸（AR，北京化學(xué)試劑公司）；氫氧化鈉（AR，汕頭西隴化工有限公司）；30%雙氧水（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硝酸鉀（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DHEA衍生物均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供批號(hào)（20120514）。

1.2 色譜條件

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 破壞試驗(yàn) 取DHEA衍生物約30mg，置25mL量瓶中，進(jìn)行如下酸、堿、氧化破壞試驗(yàn)。

1.3.1.1 酸破壞 滴加1 mol/L的鹽酸溶液 10mL，于90℃水浴中加熱8h，再加1 mol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至中性，過濾，將固體晾干后，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上清液按“1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.3.1.2 堿破壞 滴加1 mol/L的氫氧化鈉溶液10mL，于90℃水浴中加熱8h，再加1 mol/L的鹽酸溶液，調(diào)節(jié)pH至中性，過濾，將固體晾干后，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上清液按“1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.3.1.3 氧化破壞 滴加30%的過氧化氫溶液10mL，放置三天后于90℃水浴中加熱8h，過濾，將固體晾干后，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上清液按“1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析。

在酸、堿、氧化破壞實(shí)驗(yàn)中，由于DHEA衍生物幾乎不溶于水，所以破壞后過濾取其濾渣加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上清液按“1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.3.2 影響因素試驗(yàn) 穩(wěn)定性研究的考察項(xiàng)目應(yīng)選擇在藥品保存期間易于變化，并可能會(huì)影響到藥品的質(zhì)量、安全性和有效性的項(xiàng)目，以便客觀、全面地反映藥品的穩(wěn)定性。以下為影響因素穩(wěn)定性研究的一般要求。

1.3.2.1 高溫試驗(yàn) 取DHEA衍生物開口置適宜的潔凈容器中，60℃溫度下放置10天，于第5天和第10天取樣，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，并與0時(shí)間的比較。

1.3.2.2 高濕試驗(yàn) 取DHEA衍生物開口置恒濕密閉容器中，在25℃分別于相對(duì)濕度90%±5%（下部放置KNO3飽和溶液）條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，并與0時(shí)間的比較，結(jié)果見表2。

1.3.2.3 光照試驗(yàn) 取DHEA衍生物開口放在裝有日光燈的光照箱內(nèi)，在照度為4500lx±500lx的條件下放置10天，于第5天和第10天取樣，加乙腈超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，按“1.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，并與0時(shí)間的比較。

2 結(jié)果

分別選用1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液進(jìn)行破壞性試驗(yàn)。由表1可知，樣品經(jīng)過酸、堿及氧化破壞后主峰面積均在99.5%以上，也沒有雜質(zhì)降解，結(jié)果與對(duì)照品（99.53%）一樣，在實(shí)驗(yàn)過程中，為了能夠提高降解強(qiáng)度，我們從0.1 mol/L濃度一直提高到1mol/L，并且溫度也從一般的室溫20℃一直嘗試加熱到90℃，考察的時(shí)間也延長到8h，大大增加了降解條件強(qiáng)度，但試驗(yàn)結(jié)果均沒有產(chǎn)生新的降解產(chǎn)物。試驗(yàn)中，主峰的峰面積和保留時(shí)間基本上保持不變，由此也可以說明DHEA衍生物沒有被降解，主峰與有關(guān)物質(zhì)的分離度也比較好，所以在這些條件下DHEA衍生物相對(duì)穩(wěn)定。endprint

由表2可知，DHEA衍生物在高溫、光照條件下外觀性狀均為白色粉末，沒有變化，含量也相對(duì)穩(wěn)定。在中國藥典中，原料藥的穩(wěn)定性試驗(yàn)中高溫試驗(yàn)的溫度一般不超過60℃，但我們也曾試將溫度升高（至105℃）以達(dá)到降解破壞的目的，但主峰的含量及保留時(shí)間基本上還是保持不變，所以在高溫、光照試驗(yàn)中都可以說明DHEA衍生物比較穩(wěn)。在高濕條件下雖然性狀仍為白色粉末，但其含量會(huì)有所降低，只有99.4%，這是由于DHEA衍生物易吸收水分引起的，故DHEA衍生物在生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸中應(yīng)注意密封并保持干燥。有關(guān)物質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面積百分比也基本不變，而且它們能夠很好的和主峰分開，分離度都大于1.5。由此也再一次證明所建立的方法專屬性強(qiáng)。對(duì)于表2中峰面積百分比大于0.1的有關(guān)物質(zhì)Ⅲ通過HPLC、UV、GC-MS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)它為反應(yīng)原料之一DHEA，并非為新降解的產(chǎn)物，故在影響因素考察試驗(yàn)中DHEA衍生物穩(wěn)定性很好。

3 結(jié)論

本文通過HPLC法分析DHEA衍生物在溫度、濕度、光照環(huán)境中的穩(wěn)定性進(jìn)行了全面的研究，并提供了具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

經(jīng)1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液的破壞性試驗(yàn)后，主峰的保留時(shí)間沒有發(fā)生改變，未破壞出降解產(chǎn)物。且主峰的分離度均大于1.5。

在高溫、光照條件下放置10d，各項(xiàng)指標(biāo)無明顯變化，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)光照穩(wěn)定，DHEA衍生物的含量均在99%以上；在高濕（RH 90%±5%）環(huán)境中易吸水使其含量降低至99.4%。故其原料樣和相關(guān)制劑的生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯存過程中應(yīng)盡可能的避免高濕。

目前無法在破壞試驗(yàn)中得到降解產(chǎn)物，說明DHEA衍生物在這些條件下穩(wěn)定，可以為以后的相關(guān)制劑提供了參考。

本法方便、快速、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Langell J， Jennings R， Clark J， et al. Pharmacological agents for the prevention and treatment of toxic radiation exposure in spaceflight[J]. Aviation， space， and environmental medicine， 2008， 79（7）： 651-660.

[2] Stickney D R， Dowding C， Authier S， et al. 5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2007， 7（4）： 500-505.

[3] Stickney D R， Dowding C， Garsd A， et al. 5-androstenediol stimulates multilineage hematopoiesis in rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2006， 6（11）： 1706-1713.

[4] Neta R. Modulation with cytokines of radiation injury： suggested mechanisms of action[J]. Environmental health perspectives， 1997， 105（Suppl 6）： 1463.

[5] Shen Dongni， Yang Jianyun， Xiao Bingkun， Huang Rongqing*， RP-HPLC Determination of Content of Derivative of DHEA and Its Related Substances. Modern Scientific Instruments[J]. 2013， 2： 124-25

[6] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].2010年版，北京，2010：二部，附錄.endprint

由表2可知，DHEA衍生物在高溫、光照條件下外觀性狀均為白色粉末，沒有變化，含量也相對(duì)穩(wěn)定。在中國藥典中，原料藥的穩(wěn)定性試驗(yàn)中高溫試驗(yàn)的溫度一般不超過60℃，但我們也曾試將溫度升高（至105℃）以達(dá)到降解破壞的目的，但主峰的含量及保留時(shí)間基本上還是保持不變，所以在高溫、光照試驗(yàn)中都可以說明DHEA衍生物比較穩(wěn)。在高濕條件下雖然性狀仍為白色粉末，但其含量會(huì)有所降低，只有99.4%，這是由于DHEA衍生物易吸收水分引起的，故DHEA衍生物在生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸中應(yīng)注意密封并保持干燥。有關(guān)物質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面積百分比也基本不變，而且它們能夠很好的和主峰分開，分離度都大于1.5。由此也再一次證明所建立的方法專屬性強(qiáng)。對(duì)于表2中峰面積百分比大于0.1的有關(guān)物質(zhì)Ⅲ通過HPLC、UV、GC-MS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)它為反應(yīng)原料之一DHEA，并非為新降解的產(chǎn)物，故在影響因素考察試驗(yàn)中DHEA衍生物穩(wěn)定性很好。

3 結(jié)論

本文通過HPLC法分析DHEA衍生物在溫度、濕度、光照環(huán)境中的穩(wěn)定性進(jìn)行了全面的研究，并提供了具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

經(jīng)1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液的破壞性試驗(yàn)后，主峰的保留時(shí)間沒有發(fā)生改變，未破壞出降解產(chǎn)物。且主峰的分離度均大于1.5。

在高溫、光照條件下放置10d，各項(xiàng)指標(biāo)無明顯變化，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)光照穩(wěn)定，DHEA衍生物的含量均在99%以上；在高濕（RH 90%±5%）環(huán)境中易吸水使其含量降低至99.4%。故其原料樣和相關(guān)制劑的生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯存過程中應(yīng)盡可能的避免高濕。

目前無法在破壞試驗(yàn)中得到降解產(chǎn)物，說明DHEA衍生物在這些條件下穩(wěn)定，可以為以后的相關(guān)制劑提供了參考。

本法方便、快速、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Langell J， Jennings R， Clark J， et al. Pharmacological agents for the prevention and treatment of toxic radiation exposure in spaceflight[J]. Aviation， space， and environmental medicine， 2008， 79（7）： 651-660.

[2] Stickney D R， Dowding C， Authier S， et al. 5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2007， 7（4）： 500-505.

[3] Stickney D R， Dowding C， Garsd A， et al. 5-androstenediol stimulates multilineage hematopoiesis in rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2006， 6（11）： 1706-1713.

[4] Neta R. Modulation with cytokines of radiation injury： suggested mechanisms of action[J]. Environmental health perspectives， 1997， 105（Suppl 6）： 1463.

[5] Shen Dongni， Yang Jianyun， Xiao Bingkun， Huang Rongqing*， RP-HPLC Determination of Content of Derivative of DHEA and Its Related Substances. Modern Scientific Instruments[J]. 2013， 2： 124-25

[6] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].2010年版，北京，2010：二部，附錄.endprint

由表2可知，DHEA衍生物在高溫、光照條件下外觀性狀均為白色粉末，沒有變化，含量也相對(duì)穩(wěn)定。在中國藥典中，原料藥的穩(wěn)定性試驗(yàn)中高溫試驗(yàn)的溫度一般不超過60℃，但我們也曾試將溫度升高（至105℃）以達(dá)到降解破壞的目的，但主峰的含量及保留時(shí)間基本上還是保持不變，所以在高溫、光照試驗(yàn)中都可以說明DHEA衍生物比較穩(wěn)。在高濕條件下雖然性狀仍為白色粉末，但其含量會(huì)有所降低，只有99.4%，這是由于DHEA衍生物易吸收水分引起的，故DHEA衍生物在生產(chǎn)、貯存、運(yùn)輸中應(yīng)注意密封并保持干燥。有關(guān)物質(zhì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的峰面積百分比也基本不變，而且它們能夠很好的和主峰分開，分離度都大于1.5。由此也再一次證明所建立的方法專屬性強(qiáng)。對(duì)于表2中峰面積百分比大于0.1的有關(guān)物質(zhì)Ⅲ通過HPLC、UV、GC-MS進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)它為反應(yīng)原料之一DHEA，并非為新降解的產(chǎn)物，故在影響因素考察試驗(yàn)中DHEA衍生物穩(wěn)定性很好。

3 結(jié)論

本文通過HPLC法分析DHEA衍生物在溫度、濕度、光照環(huán)境中的穩(wěn)定性進(jìn)行了全面的研究，并提供了具體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

經(jīng)1mol/L鹽酸溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液的破壞性試驗(yàn)后，主峰的保留時(shí)間沒有發(fā)生改變，未破壞出降解產(chǎn)物。且主峰的分離度均大于1.5。

在高溫、光照條件下放置10d，各項(xiàng)指標(biāo)無明顯變化，對(duì)熱穩(wěn)定，對(duì)光照穩(wěn)定，DHEA衍生物的含量均在99%以上；在高濕（RH 90%±5%）環(huán)境中易吸水使其含量降低至99.4%。故其原料樣和相關(guān)制劑的生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯存過程中應(yīng)盡可能的避免高濕。

目前無法在破壞試驗(yàn)中得到降解產(chǎn)物，說明DHEA衍生物在這些條件下穩(wěn)定，可以為以后的相關(guān)制劑提供了參考。

本法方便、快速、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Langell J， Jennings R， Clark J， et al. Pharmacological agents for the prevention and treatment of toxic radiation exposure in spaceflight[J]. Aviation， space， and environmental medicine， 2008， 79（7）： 651-660.

[2] Stickney D R， Dowding C， Authier S， et al. 5-androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2007， 7（4）： 500-505.

[3] Stickney D R， Dowding C， Garsd A， et al. 5-androstenediol stimulates multilineage hematopoiesis in rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppression[J]. International immunopharmacology， 2006， 6（11）： 1706-1713.

[4] Neta R. Modulation with cytokines of radiation injury： suggested mechanisms of action[J]. Environmental health perspectives， 1997， 105（Suppl 6）： 1463.

[5] Shen Dongni， Yang Jianyun， Xiao Bingkun， Huang Rongqing*， RP-HPLC Determination of Content of Derivative of DHEA and Its Related Substances. Modern Scientific Instruments[J]. 2013， 2： 124-25

[6] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].2010年版，北京，2010：二部，附錄.endprint