方強 董丹丹 楊紅 任光國 韓泳濤 肖波

1.四川省腫瘤醫(yī)院胸外科，四川 成都610041；

2.四川省人民醫(yī)院病理科，四川 成都610072

研究表明，食管癌根治術(shù)后輔助化療能明顯延長T3、T4和淋巴結(jié)陽性患者的無病生存時間，且有可能提高生存率［1-4］。因此，術(shù)后輔助化療是綜合治療的重要環(huán)節(jié)之一。食管癌根治術(shù)后輔助化療主要針對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，但轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細胞群多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的異質(zhì)性是影響化療效果的主要因素［5］。目前有關(guān)食管鱗癌MDR的研究多限于腫瘤原發(fā)灶［6-8］，其原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR是否存在異質(zhì)性鮮見報道。本研究通過比較食管胸段鱗癌患者原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR相關(guān)蛋白肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP)、P-糖蛋白(P-gp)、拓撲異構(gòu)酶Ⅱ(TOPO-Ⅱ)、胸甘酸合成酶(TS)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST-π)表達程度的差異，為食管鱗癌根治術(shù)后選擇合理化療方案的提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇四川省腫瘤醫(yī)院胸外科2008年7月—2010年8月行食管次全切除及二野或三野淋巴結(jié)清掃術(shù)、經(jīng)病理學(xué)檢查證實為伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管胸段鱗癌患者54例，男性47例，女性7例，年齡42～71歲，中位年齡59歲，其中低分化鱗癌25例，中分化鱗癌16例，高分化鱗癌13例，所有患者術(shù)前均未行放、化療。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)位于隆突下7例，左喉返神經(jīng)旁7例，右喉返神經(jīng)旁8例，病灶旁5例，胸導(dǎo)管旁2例，賁門旁6例，胃左血管旁11例，頸部5例，奇靜脈弓旁1例，下段食管旁2例(表1)。

表1 54例食管胸段鱗癌的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics in 54 esophageal squamous cell carcinoma patients

1.2 試劑與方法

每例腫瘤原發(fā)灶、相應(yīng)的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)標本均經(jīng)4%甲醛溶液固定、櫻花VIP-E300F全自動組織脫水機處理，用Leica 2245型輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機制作石蠟標本，切片厚4 μm。即用型抗LRP、P-gp、TopoⅡ、TS、GST-π單克隆抗體均為美國Neomarker公司產(chǎn)品，購于北京中杉金橋生物試劑公司和福州邁新生物試劑公司。采用免疫組化LDP法進行切片標記，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 陽性反應(yīng)及定位

LRP、P-gp、TS、GST-π表達定位于細胞質(zhì)(LRP、TS、GST)或細胞膜(P-gp)，癌細胞胞質(zhì)內(nèi)或胞膜上(P-gp)出現(xiàn)均質(zhì)狀、顆粒狀或線條狀的棕黃色信號為陽性反應(yīng)，TopoⅡ的表達定位于細胞核，癌細胞胞核內(nèi)出現(xiàn)黃或棕黃色信號為陽性反應(yīng)。

1.3.2 結(jié)果判斷

隨機觀察10個高倍視野，癌細胞陽性數(shù)量占總計數(shù)細胞的百分比即為各抗體在癌灶標本中的表達率。結(jié)合切片內(nèi)癌細胞陽性細胞百分比與陽性細胞的信號強度，將結(jié)果分為無表達(-)：切片中無陽性腫瘤細胞，未見陽性信號；低度表達(+)：腫瘤陽性細胞數(shù)＜25%，陽性信號弱；中度表達(++)：腫瘤陽性細胞數(shù)25%～50%，陽性信號較強；高度表達(+++)：腫瘤陽性細胞數(shù)＞50%，陽性信號極強。每張切片由2位病理專家分別獨自分析，最后判斷取2位病理專家分析結(jié)果的平均值。每例腫瘤原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶所測同一MDR相關(guān)蛋白的表達結(jié)果不相同，即記為不一致，表達不一致的總例數(shù)/總病例數(shù)(54例)就是一種MDR相關(guān)蛋白的表達不一致率。同樣，對于檢測結(jié)果對耐藥的提示每例腫瘤原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶不相同，即為耐藥不一致，耐藥不一致的總例數(shù)/總病例數(shù)(54例)就是一種MDR相關(guān)蛋白的耐藥不一致率。

1.4 檢測結(jié)果對耐藥的提示

LRP、P-gp、TS、GST-π表達(++/+++)提示腫瘤對化療藥物耐藥，表達(-/+)提示腫瘤對化療藥物敏感。Topo-Ⅱ表達(-/+)提示腫瘤對化療藥物耐藥，表達(++/+++)提示腫瘤對化療藥物敏感。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗。原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的MDR相關(guān)蛋白表達比較采用Wilcoxon signedrank test，MDR相關(guān)蛋白表達與組織分化程度分析采用Kruskal Wallis test，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腫瘤原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR相關(guān)蛋白表達的異質(zhì)性

腫瘤原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶LRP、P-gp、TS、TOPO-Ⅱ、GST-π表達和耐藥不一致率分別為63.0%和26.9%、42.6%和22.2%、48.1%和25.9%、50.0%和29.6%、18.5%和1.9%。LRP在原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026)。其余4種蛋白在原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的表達沒有差異，GST-π在原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中均表達(表2、3，圖1、2)。

2.2 腫瘤原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR相關(guān)蛋白表達的異質(zhì)性與與組織分化程度的關(guān)系

Kruskal Wallis test結(jié)果顯示，腫瘤原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR相關(guān)蛋白表達的異質(zhì)性與組織分化程度無關(guān)(表4)。

圖1 食管鱗癌原發(fā)灶MDR蛋白的表達Fig.1 The expression of multidrug-resistant (MDR) proteins in primary tumors in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) patients(×100)

表2 食管胸段鱗癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR相關(guān)蛋白表達差異性變化Tab.2 The heterogenous expression of MDR associated proteins in primary tumors and metastatic lymph nodes in patients with esophageal squamous cell

表3 食管胸段鱗癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR相關(guān)蛋白表達的異質(zhì)性Tab.3 Comparison of the MDR associated protein expression levels between primary ESCC tumors and metastasized lymph nodes[n(%)]

表4 腫瘤原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR相關(guān)蛋白表達的異質(zhì)性與組織分化程度的關(guān)系Tab.4 Associations of MDR associated protein expression in primary tumors and lymph nodes based on degree of differentiation[n(%)]

圖2 食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR蛋白的表達Fig.2 The expression of MDR proteins in metastatic lymph nodes in patients diagnosed with ESCC (×100)

3 討 論

臨床上接受根治術(shù)的食管胸段鱗癌患者多屬中晚期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，成為影響預(yù)后的主要因素［9］。目前研究表明，食管癌根治術(shù)后輔助化療，雖然沒有明顯提高總生存率，但在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中有改善生存時間的趨勢。國內(nèi)的研究結(jié)果顯示，術(shù)后輔助化療提高了有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者生存率［10-11］。因此術(shù)后輔助化療仍是延長食管癌患者術(shù)后生存時間的重要環(huán)節(jié)。然而臨床結(jié)果也顯示，術(shù)后輔助化療在一部分患者中并未有效控制術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，即耐藥是困擾食管癌化療的關(guān)鍵性難題?？鼓[瘤藥物的耐藥現(xiàn)象可能是自然發(fā)生或是獲得性的。我們推測，食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細胞群MDR的異質(zhì)性變化可能是影響術(shù)后輔助化療效果的一個重要機制。

目前對消化道惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR異質(zhì)性的研究結(jié)果表明，胃癌、大腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶確實存在MDR異質(zhì)性的變化，原發(fā)灶的耐藥基因相關(guān)蛋白表達水平不能預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的MDR［12-13］。對乳腺癌原發(fā)灶與相應(yīng)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的分子遺傳學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象［14］。但對食管胸段鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR異質(zhì)性的研究目前鮮見報道。本研究結(jié)果顯示，食管胸段鱗癌原發(fā)灶與相應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶LRP、P-gp、TS、TOPO-Ⅱ、GST-π表達和耐藥不一致率分別為63.0%和26.9%、42.6%和22.2%、48.1%和25.9%、50.0%和29.6%、18.5%和1.9%。雖然只有LRP在原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026)，但仍表明食管鱗癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶存在MDR的異質(zhì)性變化。本研究結(jié)果還顯示，與胃癌、大腸癌兩種消化道腺癌不同，食管鱗癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR相關(guān)蛋白表達的差異性與組織分化程度無關(guān)。

有關(guān)消化道惡性腫瘤原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR異質(zhì)性研究的文獻中是通過比較MDR相關(guān)蛋白表達水平的差別來分析結(jié)果的。由于在免疫組化結(jié)果判斷中無表達(-)與低度表達(+)，中度表達(++)與高度表達(+++)雖然表達水平有差別，但在耐藥的提示意義上是一致的，因此檢測結(jié)果對耐藥的提示才能更好反映耐藥性的差異性。本研究結(jié)果顯示，雖然原發(fā)灶與相應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR耐藥不一致率均比表達不一致率低，但除GST-π外，LRP、P-gp、TS、TOPO-Ⅱ耐藥不一致率并不低，均在20%～30%之間，表明原發(fā)灶的MDR不能預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的MDR。

為了提高治療效果和探索新的方案，目前臨床上有更多的新藥引入食管鱗癌的化療，對傳統(tǒng)經(jīng)典的順鉑聯(lián)合5-FU方案有取代的趨向。本研究中對反映鉑制劑、植物堿類藥物敏感性的LRP和反映5-FU敏感性的TS的檢測結(jié)果顯示，大多數(shù)腫瘤原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶對上述藥物是敏感的，說明傳統(tǒng)經(jīng)典的順鉑聯(lián)合5-FU方案總體上是有效的。值得注意的是，從LRP的結(jié)果來看，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶比原發(fā)灶更敏感，因此當(dāng)檢測原發(fā)灶提示耐藥時，仍有必要檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。本研究對P-gp檢測的結(jié)果顯示腫瘤原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶總體上對紫杉醇、長春堿類藥物敏感，而TOPO-Ⅱ的檢測結(jié)果反映出腫瘤原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶總體上對伊立替康不敏感。GST-π在原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中均表達且主要是中高度表達，提示對于反映此類機制的藥物如環(huán)磷酰胺、氮芥、瘤可寧類藥物均不適合。綜上所述，食管鱗癌存在原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR的異質(zhì)性現(xiàn)象，僅檢測原發(fā)灶MDR相關(guān)蛋白水平難以反映淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶或微轉(zhuǎn)移灶的MDR。食管癌根治術(shù)后影響遠期療效的主要原因之一是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此術(shù)后輔助化療主要針對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶MDR相關(guān)蛋白表達水平有助于指導(dǎo)食管鱗癌術(shù)后選擇合理化療方案，從而可提高術(shù)后輔助化療效果。

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