田聰 湯麗娜 林峰 沈贊 陳杰 姚陽(yáng) 閔大六

1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部研究生院，江蘇 蘇州 215131；

2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200233；

3 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院病理科，上海 200233

骨肉瘤是常見(jiàn)的骨原發(fā)性惡性腫瘤，年發(fā)病率約為0.2～0.3/10萬(wàn)，好發(fā)于青少年，男女之比為1.5∶1［1］。自上世紀(jì)70年代以來(lái)，骨肉瘤的治療采用了先術(shù)前化療、再擇期手術(shù)、最后行術(shù)后輔助化療的綜合治療模式，從而使患者的預(yù)后有了明顯的改善［2］，5年生存率目前達(dá)60%，但是仍有一部分患者對(duì)化療藥產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，最終治療失敗而死亡［3］。骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展是多因素參與、多步驟發(fā)展的生物學(xué)過(guò)程，深入理解骨肉瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)尋找理想的治療靶點(diǎn)具有重要意義。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，p21活化激酶5(p21-activated kinase 5，PAK5)蛋白與某些惡性腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4-5］，但其在骨肉瘤中的作用研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)92例骨肉瘤和33例骨巨細(xì)胞瘤標(biāo)本中PAK5的表達(dá)，旨在探討PAK5表達(dá)與骨肉瘤患者臨床特點(diǎn)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2004年1月—2010年6月臨床資料完整的原發(fā)性骨肉瘤穿刺活檢組織石蠟標(biāo)本，選擇其中活檢前未作過(guò)任何治療，病理確診后經(jīng)過(guò)術(shù)前化療、手術(shù)、術(shù)后化療或聯(lián)合其他治療的規(guī)范化綜合治療92例患者。其中男性63例，女性29例，男女之比為2.2∶1。患者年齡7～75歲，中位年齡18歲。腫瘤部位：股骨49例，脛腓骨35例，肱骨5例，其他部位3例。按照Enneking外科分期：Ⅱ期74例，Ⅲ期1 8 例。所有患者的石蠟塊病理均切片HE染色復(fù)讀確診，采用病理切片號(hào)隨機(jī)切片、免疫組化實(shí)驗(yàn)，盲法分析。另隨機(jī)取骨巨細(xì)胞瘤33例作為陰性對(duì)照。全部患者均采用電話(huà)或定期門(mén)診隨訪(fǎng)，中位隨訪(fǎng)時(shí)間3 2個(gè)月。

1.2 主要試劑及方法

鼠抗人PAK5抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二抗為酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物，購(gòu)自福州邁新公司。所有組織均為10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫鈣，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)PAK5的表達(dá)。染色步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，PAK5單抗工作濃度為1∶100。以試劑盒提供的已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

PAK5陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，以陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)占同類(lèi)細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)作為計(jì)數(shù)點(diǎn)，取其平均值為該患者的細(xì)胞陽(yáng)性率，并據(jù)此對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞著色為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。同時(shí)根據(jù)染色強(qiáng)度加以評(píng)分，未見(jiàn)染色為0分，輕度染色(淡黃色)為1分，中度染色(棕黃色)為2分，深度染色(棕褐色)為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與著色強(qiáng)度得分的乘積作為最終判定結(jié)果，陰性(-)0分，弱陽(yáng)性(+)1～3分，陽(yáng)性(++)4～6分，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)＞6分。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果經(jīng)2位病理學(xué)專(zhuān)職工作者依據(jù)相同的標(biāo)準(zhǔn)雙盲判定，相同判定結(jié)果直接納入統(tǒng)計(jì)，有差異的結(jié)果經(jīng)另一位病理醫(yī)師雙盲判定后取3位判定的平均值納入統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。陽(yáng)性率之間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank非參數(shù)檢驗(yàn)，并繪制生存曲線(xiàn)；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PAK5在骨肉瘤組織中的表達(dá)

PAK5陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒(圖1)。92例骨肉瘤標(biāo)本中，66例PAK5蛋白陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為71.7%(66/92)；其中(-)26例，(+)22例，(++)30例，(+++)14例。而陰性對(duì)照的33例骨巨細(xì)胞瘤標(biāo)本中均未見(jiàn)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 PAK5表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

PAK5表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類(lèi)型及局部復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)，而與Enneking分期、腫瘤壞死率及肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Enneking Ⅲ期及發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者其PAK5的表達(dá)水平明顯高于Enneking Ⅱ期及未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.019和0.000，表2)。

圖1 PAK5在骨肉瘤組織中的表達(dá)Fig.1 PAK5 expression in osteosarcoma tissues

表1 骨巨細(xì)胞瘤和骨肉瘤中PAK5的表達(dá)Tab.1 PAK5 expression in osteoclastoma and osteosarcoma

表2 骨肉瘤組織中PAK5表達(dá)與臨床參數(shù)之間的關(guān)系Tab.2 The relationship between PAK5 expression and clinical factors in osteosarcoma

本組92例骨肉瘤患者中，61例腫瘤壞死率<90%，其PAK5陽(yáng)性表達(dá)率為80.3%(49/61)；31例腫瘤壞死率≥90%，其PAK5陽(yáng)性表達(dá)率為54.8%(17/31)；將腫瘤壞死率≥90%視為化療有效，PAK5陰性表達(dá)患者的化療有效率為53.8%(14/26)，顯著高于PAK5陽(yáng)性表達(dá)的化療有效率，后者為25.8%(17/66)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014，表3)。

2.3 PAK5的表達(dá)與骨肉瘤患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示，本組PAK5陽(yáng)性表達(dá)的患者3年生存率為21.2%(14/66)，而陰性表達(dá)的患者3年生存率為69.2%(18/26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PAK5陽(yáng)性表達(dá)的患者中位生存時(shí)間顯著低于陰性表達(dá)的患者，前者為29個(gè)月(95%CI：26～32)，后者為55個(gè)月(95%CI:41～69)。經(jīng)單因素生存分析表明，性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)分型、腫瘤壞死率與骨肉瘤患者預(yù)后無(wú)關(guān)；腫瘤大小、Enneking分期、局部復(fù)發(fā)、肺轉(zhuǎn)移及PAK5的表達(dá)是影響骨肉瘤患者預(yù)后的因素(圖2)。Cox回歸多因素分析顯示，PAK5的表達(dá)(P=0.001)及肺轉(zhuǎn)移(P=0.015)是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(表4)。

表3 PAK5表達(dá)與化療有效率之間的關(guān)系Tab.3 The relationship between PAK5 expression and the effi ciency of chemotherapy

表4 COX多因素模型回歸分析影響骨肉瘤患者預(yù)后的因素Tab.4 Cox regression analysis of prognostic factors in osteosarcoma

3 討 論

p21活化激酶(p21-activated kinase，PAKs)蛋白是進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞生存、細(xì)胞凋亡、血管生成和有絲分裂等生物學(xué)功能［6］。PAKs分為PAKs Ⅰ和PAKs Ⅱ，PAKs Ⅰ包括PAK1、2、3，PAKs Ⅱ包括PAK4、5、6［7］。PAK5也被稱(chēng)作PAK7，PAK5為PAKs家族中新近發(fā)現(xiàn)的成員，也是PAKs家族中研究最少的激酶之一［4］，主要在神經(jīng)組織中高表達(dá)，在神經(jīng)細(xì)胞的突觸傳遞起重要作用。最近有數(shù)據(jù)顯示，PAK5在人的胰臟、卵巢、睪丸和腸組織中都有表達(dá)［8］。Cotteret等［9］發(fā)現(xiàn)PAK5既能在112位絲氨酸直接磷酸化BAD蛋白，也能通過(guò)AKT途徑間接于136位絲氨酸磷酸化BAD蛋白，從而阻止細(xì)胞凋亡。近來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PAK5參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如腸癌［5,10］、胃癌［4］，隨著惡性程度的增強(qiáng)，PAK5的表達(dá)逐漸增加。然而，PAK5在骨肉瘤中的作用目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)道。

PAK5是一種已知且能活化細(xì)胞生存信號(hào)通路的蛋白，主要定位于線(xiàn)粒體中，具有保護(hù)細(xì)胞生存的功能［11］。本研究發(fā)現(xiàn)PAK5蛋白表達(dá)于骨肉瘤組織中的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，提示PAK5蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。既往研究證明，PAK5對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用與其在細(xì)胞中的定位有著密切的關(guān)系，只有當(dāng)PAK5定位于線(xiàn)粒體時(shí)才能磷酸化BAD，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。而當(dāng)PAK5定位于細(xì)胞核時(shí)不能有效的磷酸化BAD，不再對(duì)抗細(xì)胞凋亡的刺激［9］。

圖2 92例骨肉瘤患者log-rank生存分析Fig.2 Log-rank survival analysis of the 92 patients with osteosarcoma

本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)33例骨巨細(xì)胞瘤及92例骨肉瘤患者中PAK5的表達(dá)，結(jié)果前者未見(jiàn)PAK5蛋白陽(yáng)性表達(dá)，而后者共有66例患者PAK5蛋白陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率高達(dá)71.7%(66/92)。PAK5蛋白表達(dá)高低與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織學(xué)類(lèi)型及局部復(fù)發(fā)無(wú)明顯關(guān)系，而與Enneking分期及肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。骨肉瘤Enneking Ⅱ期的患者PAK5陽(yáng)性率為66.2%(49/74)，Enneking Ⅲ期的患者PAK5陽(yáng)性率為94.4%(17/18)；遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤者PAK5陽(yáng)性率為90.4%(47/52)，無(wú)遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤者陽(yáng)性率為47.5%(19/40)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.019和0.000)。本研究結(jié)果還顯示，PAK5陽(yáng)性表達(dá)者的3年生存率及中位生存時(shí)間顯著短于PAK5陰性表達(dá)者，提示PAK5高表達(dá)的患者預(yù)后較差。且經(jīng)單因素及多因素分析發(fā)現(xiàn)，PAK5的表達(dá)(P=0.001)及肺轉(zhuǎn)移(P=0.015)是影響骨肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。以上結(jié)果提示PAK5可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展且影響患者的預(yù)后，其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。

化療作為骨肉瘤治療的主要輔助手段，在骨肉瘤的綜合治療中起著重要的作用［12］?；煹拿舾行詫?duì)骨肉瘤的療效和預(yù)后有著重要的影響［13-14］。腫 瘤化療的作用機(jī)制之一是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡基因的改變必然對(duì)化療的效果產(chǎn)生影響［15］。且新輔助化療后腫瘤壞死率是目前預(yù)測(cè)骨肉瘤患者對(duì)化療反應(yīng)的最直接、也最可靠的指標(biāo)，腫瘤壞死率高的患者，其化療有效率往往較高，預(yù)后較好［16］。本組檢測(cè)結(jié)果顯示，92例骨肉瘤患者中，61例化療后腫瘤壞死率<90%，化療前PAK5陽(yáng)性表達(dá)率為80.3%(49/61)；31例化療后腫瘤壞死率≥90%，化療前PAK5陽(yáng)性表達(dá)率54.8%(17/31)，表明腫瘤壞死率低的患者PAK5表達(dá)明顯高于腫瘤壞死率高的患者。同時(shí)PAK5陰性表達(dá)者化療有效率53.8%(14/26)高于PAK5陽(yáng)性表達(dá)者化療有效率25.8%(17/66)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)，提示PAK5高表達(dá)會(huì)降低化療的有效率，同時(shí)也提示PAK5的檢測(cè)或許可以作為骨肉瘤化療敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)。PAK5影響化療有效率的機(jī)制目前尚不清楚，推測(cè)可能與細(xì)胞凋亡及骨肉瘤獲得性耐藥有一定關(guān)系，具體機(jī)制有待下一步深入研究。

本研究結(jié)果初步揭示了PKA5蛋白的表達(dá)與骨肉瘤臨床病理及生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系，提示PAK5可作為判斷骨肉瘤生物學(xué)行為及預(yù)后的一個(gè)有價(jià)值指標(biāo)，也可能是骨肉瘤診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。PAK5在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中的確切作用機(jī)制有待于下一步深入研究。

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