【作 者】吳世福，劉成虎，侯麗，孫曉霞，蓋瀟瀟，施燕平

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心；山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點實驗室，濟南市，250101

近年來，隨著人們對醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)安全性認識的不斷深入，針對醫(yī)療器械，特別是動物源性醫(yī)療器械和組織工程產(chǎn)品中免疫原的評價逐漸成為醫(yī)療器械產(chǎn)品開發(fā)和安全性評價的熱點領(lǐng)域之一。眾所周知，有效控制醫(yī)療器械中含有的免疫原是控制相關(guān)產(chǎn)品潛在免疫毒性反應(yīng)的關(guān)鍵所在。一般來說，機體對醫(yī)療器械中免疫原的反應(yīng)大體可以分為體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答兩大類。其中，淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗是反映免疫原誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的重要方法。其原理為當淋巴細胞在受到免疫原刺激時，可發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)并發(fā)生轉(zhuǎn)化和增殖，通過檢測淋巴細胞轉(zhuǎn)化和增殖能力的強弱即可判定免疫原刺激能力的大小。

目前，實驗室中常用于檢測淋巴細胞轉(zhuǎn)化和增殖的方法主要有3H-TdR摻入法和MTT法[1-2]。3H-TdR摻入法雖然敏感性較高，但需要實驗室具有使用放射性材料的資質(zhì)并且操作人員需取得相應(yīng)的操作合格證書。因此，難以在大范圍內(nèi)推廣。相比較而言，MTT法雖然具有操作簡便、快捷和安全等優(yōu)點，但卻難以排除不同群體淋巴細胞之間存在的干擾因素，因此在適用范圍上也受到了一定的限制。羧基熒光素乙酰乙酸（CFSE）是近年來使用較為普遍的一種用于檢測細胞增殖的熒光染色標志物[3-4]。它可以穿透活細胞膜并不可逆地與活體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。當細胞分裂時，CFSE標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，其熒光強度也變?yōu)橛H代細胞的一半。因此，在一個增殖的細胞群中，各個連續(xù)細胞代的熒光強度呈2倍遞減。將CFSE標記的淋巴細胞通過流式細胞術(shù)進行分析，可以快速準確地檢測出特定亞群淋巴細胞的轉(zhuǎn)化和增殖情況。與MTT法相比，CFSE標記法不但具有準確、快捷等優(yōu)點，還與MTT法之存在良好的關(guān)聯(lián)性。

膠原蛋白海綿是近年來開發(fā)上市的一種新型動物源性功能敷料。該產(chǎn)品的膠原成分一般取自牛跟腱，經(jīng)不同加工工藝處理制得膠原蛋白海綿，主要用于創(chuàng)面止血和創(chuàng)傷修復(fù)，為可降解植入類醫(yī)療器械產(chǎn)品，并且具有良好的生物相容性。但是作為動物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品，其在加工處理過程中無法徹底消除免疫原性。因此，選用合適的免疫原性評價方法對該類產(chǎn)品進行評價，將會有助于消除其潛在的免疫毒理學(xué)風(fēng)險。根據(jù)ISO10993-20[5]中推薦采用的淋巴細胞增殖試驗來評價醫(yī)療器械對淋巴細胞免疫功能的方法，本研究分別在體外利用MTT法和CFSE法研究膠原蛋白海綿浸提液對小鼠脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化和增殖作用的影響，旨在評價膠原蛋白海綿的免疫原性并探索建立一套體外評價醫(yī)療器械免疫原性的優(yōu)化方法。

1 材料與方法

1.1 動物和細胞

雌性BALB/c小鼠，(6～8)周齡，(18～22)g，購自山東魯抗實驗動物中心；L929細胞系購自中國實驗細胞庫。

1.2 試劑和器具

所以試劑 刀豆蛋白A Ⅳ型(ConA)和脂多糖(LPS)(Sigma公司)；MTT(Sigma公司)；CFSE(Invitrogen公司)；PE-CD3抗體(eBioscience，USA)；RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)。所用器具 倒置顯微鏡(Olympus TH4-200)；快速細胞分析儀(CASY-TT，德國innovatis AG)；全自動酶標儀(Multiskan MK3)；流式細胞儀（Becton Dickinson,USA）。

1.3 試驗樣品及處理

膠原蛋白海綿由合作單位提供。細胞毒性試驗中陰性對照產(chǎn)品高密度聚乙烯和陽性對照SPUZDEC均購自日本Hatano研究所。按照ISO10993-12的原則[6]，取30 cm2無菌膠原蛋白海綿樣品，以RPMI1640完全培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，測定“吸收容量”后，按照6 cm2/mL的比例，在37±1oC的條件下浸提72±2 h，制備浸提液備用。

1.4 細胞毒性篩選試驗

陽性對照組和陰性對照分別選取MEM完全培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，按照0.1g/mL的比例，在37±1oC的條件下浸提24±2 h，制備浸提液，按ISO10993-5[7]中要求，對SPU-ZDEC、高密度聚乙烯和膠原蛋白海綿產(chǎn)品的浸提液進行體外細胞毒性篩選試驗。

1.5 淋巴細胞制備

脫頸椎處死3只BALB/c小鼠，無菌取脾，研磨制備單細胞懸液，收集細胞懸液，混合后 400 g離心5 min，棄上清，加5 mL紅細胞裂解液，混勻，4oC孵育5 min，加入含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液終止反應(yīng)，400 g離心5 min，棄上清，加入含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至 2×106U/mL。

1.6 試驗分組

試驗共分為以下幾組：

(1)陰性對照組（細胞對照，VC）；

(2)陽性對照組1（細胞+ ConA，5 μg/mL）；

(3)陽性對照組2（細胞+ LPS，10 μg/mL）；

(4)試驗組1：細胞+第一種濃度抗原(浸提液原液)；

(5)試驗組2：細胞+第二種濃度抗原（浸提液原液50%稀釋）。

1.7 試驗步驟

1.7.1 MTT試驗

將細胞懸液加入96孔板，每孔200 μL，設(shè)6個復(fù)孔。陽性對照組1加入ConA至終濃度為5 μg/mL，陽性對照組2加入LPS至終濃度為10 μg/mL，試驗平板在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d 后取出，600 g離心5 min，棄上清，加入MTT（1 mg/mL），50 μL /孔，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，加入DMSO，150 μL/孔，振蕩平板至甲臜顆粒完全溶解，在酶標儀上570 nm波長處測定吸光度值（OD），參照波長為630 nm。

1.7.2 CFSE試驗

無菌制備小鼠脾臟淋巴細胞懸液，用PBS至少洗2次，用2 mL含0.1%BSA的PBS重懸細胞，分別加入CFSE，終濃度為5 μMol/L。37oC避光孵育15 min～30 min。加入3 mL預(yù)冷的含2%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液終止染色反應(yīng)，冰上放置5 min后400 g離心5 min，加入含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液2 mL。按實驗分組將細胞懸液加入24孔板，1 mL/孔，每組設(shè)3個復(fù)孔。試驗平板在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，收集各孔細胞，用PE標記的抗小鼠CD3單克隆抗體在4oC避光條件下孵育30 min后，應(yīng)用流式細胞術(shù)進行分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

1.8.1 MTT試驗

記錄各組吸光度A的平均值。應(yīng)用t-檢驗法來判定試驗結(jié)果。與陰性對照組相比，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.8.2 CFSE試驗

記錄各組淋巴細胞的增殖百分比。應(yīng)用t-檢驗法來判定試驗結(jié)果。與陰性對照組相比，P<0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞毒性篩選試驗結(jié)果

按ISO10993-5:2009的要求采用浸提液接觸法進行細胞毒性試驗，結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組細胞生長繁殖旺盛，形態(tài)良好。陽性對照組細胞在48 h內(nèi)100%細胞發(fā)生圓縮死亡。各試驗樣品組細胞生長繁殖旺盛，形態(tài)良好。正常細胞數(shù)量不少于空白對照組的80%。因此，定性判定試驗樣品浸提液對L929細胞的細胞毒性為I級，表明該產(chǎn)品的浸提液無明顯細胞毒性作用。

2.2 MTT法檢測體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化的結(jié)果

在細胞毒性篩選的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗分組利用MTT法進行體外淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組吸光度A顯著增加（P<0.05），而試驗組與陰性對照組之間吸光度A值無明顯差異（P>0.05），表明膠原蛋白海綿產(chǎn)品浸提液不能在體外引起小鼠脾臟淋巴細胞發(fā)生明顯的增殖和轉(zhuǎn)化（見圖1）。

圖1 MTT法測定小鼠體外脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化結(jié)果（*P<0.05）Fig.1 Results of mouse splenic lymphocyte transformation assay with MTT method in vitro (*P<0.05)

2.3 CFSE法檢測體外T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗的結(jié)果

在MTT試驗結(jié)果的基礎(chǔ)之上，我們進一步選用CFSE熒光摻入和PE-CD3抗體標記染色法分析試驗樣品對T淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖的影響。流式結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組細胞發(fā)生明顯增殖，出現(xiàn)了多個增殖峰，增殖百分率從（6.01±0.9）%增加到（14.7±0.1）%，見圖2(a)和圖2(b)，而實驗組細胞與對照組細胞間無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

圖2 CFSE法測定小鼠體外脾臟T淋巴細胞轉(zhuǎn)化結(jié)果（*P<0.05）Fig.2 Results of mouse splenic T lymphocyte transformation assay with CFSE method in vitro (*P<0.05)

多年來，免疫應(yīng)答的特性一直是研究的熱點領(lǐng)域。然而，關(guān)于醫(yī)療器械/材料免疫原性的研究卻很少。并且，目前還不清楚醫(yī)療器械/材料刺激機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答對宿主有利還是有害。因此，應(yīng)用醫(yī)療器械/材料或其浸提物進行免疫應(yīng)答研究來獲取相關(guān)的信息是非常重要的，特別是針對動物源性醫(yī)療器械，由于缺少評價免疫原性的技術(shù)和方法，很多該類產(chǎn)品在沒有經(jīng)過充分安全性評價的情況下上市，為臨床應(yīng)用和患者的健康留下了隱患。因此，亟需在傳統(tǒng)組織學(xué)評價方法的基礎(chǔ)上，開發(fā)出新的安全性評價方法來評價該類器械潛在的免疫毒理學(xué)作用以及對臨床使用后組織重建的長期影響。淋巴細胞增殖和轉(zhuǎn)化能力是衡量機體細胞免疫功能的重要指標，針對淋巴細胞增殖和轉(zhuǎn)化能力的研究將有助于揭示醫(yī)療器械作用于人體后潛在的免疫毒理學(xué)反應(yīng)。

在本研究中，我們首先對所選取的動物源性膠原蛋白海綿浸提液進行了體外細胞毒性研究，定性評價結(jié)果顯示，該產(chǎn)品浸提液無明顯細胞毒性作用。這為進一步使用MTT和CFSE標記進行淋巴細胞增殖和轉(zhuǎn)化研究提供了前提條件。在MTT試驗中，各實驗組細胞吸光度值均小于陽性對照組，提示試驗組細胞增殖程度小于陽性對照組，但各實驗組之間無顯著性差異（見圖1）。在CFSE熒光標記法中，陽性對照組細胞發(fā)生明顯多峰增殖現(xiàn)象，而與對照組相比，各試驗組細胞中CD3+T淋巴細胞未發(fā)生明顯增殖（見圖2），這表明，MTT法與CFSE法之間存在良好的關(guān)聯(lián)性。但是，與MTT法只能分析全部細胞增殖情況不同，結(jié)合熒光抗體標記及流式細胞術(shù)，CFSE法可以便捷、高效地分析出小鼠脾臟淋巴細胞中CD3+T細胞群體的增殖情況。例如，MTT法無法區(qū)分這一群細胞總體分裂一次與這群細胞中1/2的細胞分裂兩次測得的結(jié)果，而CFSE法則可以清晰追蹤特定細胞群體的整個分裂增殖過程。這里需要注意的是，實驗組細胞的平均熒光強度高于對照組，初步考慮為試驗樣品浸提液的處理促進了CFSE與淋巴細胞之間的結(jié)合，但具體機制還需要進一步的研究。

影響本研究的關(guān)鍵因素包括ConA和LPS的濃度、試驗周期的長短和CFSE的標記條件以及細胞計數(shù)的準確性。試驗中，我們選用的ConA終濃度為5 μg/mL，這是在參考文獻報道和預(yù)實驗基礎(chǔ)上給出的濃度[8]。結(jié)果顯示，5 μg/mL 的ConA能夠較好地保證試驗系統(tǒng)的正常工作，同時也可用于比較T淋巴細胞對絲裂原和免疫原的免疫應(yīng)答。而LPS的濃度則是依據(jù)預(yù)實驗得出的。試驗周期的選擇是影響本研究的另一重要因素。針對淋巴細胞對生物材料中免疫原的應(yīng)答，ASTM F1906標準[9]中推薦的試驗周期為7 d，我們先后選用3 d、5 d和7 d的培養(yǎng)體系，綜合考慮細胞增殖高峰期和熒光淬滅等多種因素的影響，最終確定采用3 d的培養(yǎng)體系進行試驗。但是具體到不同的試驗樣品，建議實驗者根據(jù)試驗樣品的特性、文獻報道以及預(yù)實驗的結(jié)果來確定具體的試驗周期。CFSE的標記條件也是在參考文獻報道和預(yù)實驗的基礎(chǔ)上給出的[10]。結(jié)果顯示，在選用終濃度為5 μMol/L的 CFSE時，37oC避光孵育15 min～30 min的標記時間符合該試驗的要求。需要注意的是，不同CFSE試劑盒中會有不同的標記濃度和標記時間，實驗者應(yīng)根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果來摸索具體的標記條件。本研究采用德國CASY-TT自動細胞計數(shù)儀，將脾淋巴細胞計數(shù)到2×106U/mL，計數(shù)結(jié)果比手工計數(shù)更為準確，有效保證了試驗結(jié)果的嚴謹性和科學(xué)性。

另外，試驗中需嚴格遵守?zé)o菌操作規(guī)則。一般不建議在試驗培養(yǎng)液中使用除青霉素/鏈霉素或慶大霉素以外的抗生素，因為它們的作用方式有可能干擾到細胞免疫應(yīng)答。本研究通過CFSE熒光標記術(shù)來研究動物源醫(yī)療器械對小鼠脾臟淋巴細胞轉(zhuǎn)化和增殖作用的影響，并將其與傳統(tǒng)的MTT法進行比較，為CFSE法在醫(yī)療器械免疫原性檢測中的運用奠定了基礎(chǔ)。

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