■李 楠 趙辰龍 周瑞芳 鄧智年 張娥珍

(1.廣西大學生命科學與技術(shù)學院，廣西南寧 530005；2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室，廣西南寧 530007；3.廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西南寧 530007)

目前甘蔗種植面積最大的國家是巴西，其次是印度，中國位居第三。而廣西占全國甘蔗種植面積的63%[1]。甘蔗收割后的蔗葉和甘蔗榨糖后的糖蜜，都是甘蔗產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品，據(jù)估計我國每年產(chǎn)生的蔗葉1 500 t、糖蜜300 t[2]。有效利用這些副產(chǎn)品，實現(xiàn)甘蔗的綜合利用，將會增加甘蔗產(chǎn)業(yè)的附加效益，對廣西的經(jīng)濟發(fā)展有十分積極的意義。

新鮮甘蔗尾葉含水量高達70%，而干燥后的蔗葉約含有30%的粗纖維，7%的粗蛋白質(zhì)，32%的糖類，7%的有機酸，并含有一定數(shù)量的脂肪、淀粉、維生素等[3]，可以代替牧草成為良好的飼料資源，許多研究表明其育肥效果明顯[4-8]。甘蔗收獲期在11月至翌年4月，甘蔗收獲后遺留的蔗葉總量巨大，此時正值枯草期，利用甘蔗尾葉作青飼料，成本低，可以解決越冬渡春時期牧草飼料不足的難題[9－10]。但是甘蔗尾葉的粗纖維含量高，而蛋白質(zhì)含量較低，依然有較多不足之處。甘蔗糖蜜主要成分為糖類，是生產(chǎn)酵母的優(yōu)質(zhì)原料，也可直接用作動物飼料，能大大改善飼料適口性，提高瘤胃微生物的活性，提高采食量和消化能力[11]。還可以起到黏結(jié)劑作用，減少飼料粉塵，提高飼料顆粒質(zhì)量等優(yōu)點[12]。

為解決甘蔗尾葉作為飼料的存在諸多問題，本實驗使用糖蜜彌補蔗葉纖維含量高、蛋白含量低的缺點，確定了多菌種混合半固態(tài)發(fā)酵工藝條件，適當?shù)慕到獠糠掷w維，同時提高發(fā)酵產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量，改善適口性和營養(yǎng)價值，綜合利用甘蔗糖業(yè)副產(chǎn)品生產(chǎn)具有較高營養(yǎng)價值的飼料。利用甘蔗尾葉與糖蜜生產(chǎn)飼料能夠有效降低飼料生產(chǎn)成本，又能實現(xiàn)資源的綜合利用，避免蔗葉燃燒和糖蜜酒精廢液帶來的污染，實現(xiàn)蔗糖業(yè)與養(yǎng)殖業(yè)的互相促進和可持續(xù)發(fā)展，為甘蔗資源的綜合利用和拓展飼料資源提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源：綠色木霉，產(chǎn)朊假絲酵母（廣西大學食品發(fā)酵研究所保藏）。

甘蔗尾葉：廣西農(nóng)業(yè)科學院武鳴實驗基地實驗田種植。

甘蔗糖蜜：廣西南寧糖業(yè)股份有限公司明陽糖廠。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：20%馬鈴薯汁1 L，蔗糖20.0 g（國藥集團化學試劑有限公司），KH2PO43 g（國藥集團化學試劑有限公司），MgSO4·7H2O 1.5 g（國藥集團化學試劑有限公司），硫胺素8 mg（國藥集團化學試劑有限公司），瓊脂20.0 g（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司），pH值6.5。

種子培養(yǎng)基：20%馬鈴薯汁1 L，蔗糖20.0 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，硫胺素 8 mg，pH值6.5。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗葉干燥粉碎后過20目篩，取5 g置于250 ml三角瓶內(nèi)，以1∶4的固液比加入稀釋到12°Bx的甘蔗糖蜜，混合均勻后滅菌。

1.3 主要儀器

XT-200型高速多功能粉碎機(浙江永康紅太陽機電有限公司)；BS 423 S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；SPX-250恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；ZDDN-II自動凱氏定氮儀(浙江托普儀器有限公司)等儀器。

1.4 試驗方法

1.4.1 斜面培養(yǎng)

在無菌操作臺上用接種針挑取少量待接菌體移入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)，木霉培養(yǎng)5～7 d，酵母菌培養(yǎng)2 d。

1.4.2 種子液的制備

向接斜面試管中接入3 ml無菌水，用接種針刮取適量菌體，接入250 ml的三角瓶中，裝液量為50 ml，28℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.4.3 固態(tài)發(fā)酵

接種適量的木霉和酵母菌液體種子至固體發(fā)酵培養(yǎng)基，使用玻璃棒攪拌，充分混合后恒溫靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)期間定時翻料。

1.4.4 發(fā)酵條件優(yōu)化試驗

暫定初始發(fā)酵條件：固液比為1∶4，糖蜜錘度12°Bx，pH值為7，總接種量為40%，木霉與酵母的接種比例為1∶1，培養(yǎng)溫度28℃，發(fā)酵時間5 d?？疾觳煌蛩貙Ξa(chǎn)品粗蛋白質(zhì)含量的影響。

發(fā)酵時間：其他條件為初始條件，接種后分別培養(yǎng)4、5、6、7、8 d后測定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量。

總接種量：分別按40%、50%、60%、70%、80%的總接種量接種，發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量。

固液比：將干物料與稀釋糖蜜分別按1∶1；1∶2；1∶3；1∶4；1∶5；1∶6的比例混合后制備培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量。

糖蜜pH值：只改變稀釋糖蜜的pH值，分別調(diào)整糖蜜的pH值為6、6.5、7、7.5、8，發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量。

糖蜜錘度：分別將糖蜜稀釋為12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 °Bx后配制發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量。

接種比例：總接種量為40%，將木霉與酵母按不同比例接種（2∶1；1∶1；1∶2；1∶3；1∶4），發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)含量。

1.4.5 粗蛋白質(zhì)（CP）的測定方法

發(fā)酵完成后將樣品置于60℃烘箱干燥后，按照GB/T 6432-1994中方法測定粗蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時間對粗蛋白質(zhì)含量的影響(見圖1)

從圖1可知，在初始培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，粗蛋白質(zhì)含量逐漸增加，當培養(yǎng)時間為5 d達到最大。培養(yǎng)時間超過5 d后，粗蛋白質(zhì)含量則逐漸減少。因此，發(fā)酵時間選擇5 d最佳。

2.2 接種量對粗蛋白質(zhì)含量的影響

接種量的大小影響發(fā)酵的周期和產(chǎn)量：接種量小，菌體延滯期較長從而延長發(fā)酵周期，增加了污染幾率和動力消耗；接種量大，有利于充分利用營養(yǎng)物質(zhì)，縮短發(fā)酵周期，降低功耗與成本。分別以40%、50%、60%、70%、80%接種量接入培養(yǎng)基中發(fā)酵，菌種比例為1∶1，考察最適接種量。實驗結(jié)果如圖2所示，在總接種量為50%，即單菌接種量為25%時，具有最大的粗蛋白質(zhì)含量，所以將最佳接種量定為50%。

2.3 固液比對粗蛋白質(zhì)含量的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基的固液比對發(fā)酵過程有重要的影響。由于糖蜜成分復(fù)雜多樣，含大量糖類、有機物和無機鹽離子，是發(fā)酵過程中微生物生長代謝所需要的營養(yǎng)物質(zhì)主要來源，所以固液比直接影響培養(yǎng)基的碳源、氮源、和無機鹽含量。此外固液比也對培養(yǎng)基物理狀態(tài)有直接影響，液體比例越小，基質(zhì)越干燥，空隙較多，通氣性越好；反之則越接近流體，在靜置培養(yǎng)條件下，通氣性較差。由于該實驗屬于好氧發(fā)酵，液體比例過少則培養(yǎng)基中營養(yǎng)供應(yīng)不足，而過多則會影響通氣，從而影響菌體生長。所以固液比應(yīng)適中，在提供足夠營養(yǎng)的同時具有一定的通透性，以保證氧的傳遞。由圖3可知，隨著液體比例的增大，粗蛋白質(zhì)含量不斷增大；固液比為1∶4時達蛋白質(zhì)含量最高點，比例為1∶5時粗蛋白質(zhì)含量與其相差不多；再增加液體比例則粗蛋白質(zhì)含量不斷降低，從節(jié)省物料的角度考慮最佳固液比為1∶4。

2.4 pH值對粗蛋白質(zhì)含量的影響

pH值影響著微生物細胞膜通透性、各種酶的活性、底物結(jié)合等多個方面，合適的pH值有利于微生物的繁殖及產(chǎn)物的合成。通過該項實驗以確定發(fā)酵的最佳pH值。實驗結(jié)果(見圖4)表明：糖蜜pH值為6.5時，粗蛋白質(zhì)含量最高，故稀釋糖蜜的最適pH值為6.5。

2.5 糖蜜錘度對粗蛋白質(zhì)含量的影響

稀釋糖蜜是發(fā)酵過程中碳源、氮源和無機鹽離子等營養(yǎng)物質(zhì)的主要提供者，將糖蜜稀釋成不同錘度后配制培養(yǎng)基，可以改變各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，從而影響菌體生長和產(chǎn)物合成。同時糖蜜錘度也影響著培養(yǎng)基的黏稠度和通氣性。結(jié)果如圖5所示，在糖蜜錘度為28°Bx時，粗蛋白質(zhì)含量最大。當濃度較低時，培養(yǎng)基不能滿足微生物的生長代謝的營養(yǎng)需求，粗蛋白質(zhì)含量較低；濃度過高則培養(yǎng)基中的色素、金屬離子和其他有害物質(zhì)濃度變大，培養(yǎng)基黏稠度高造成氧氣供應(yīng)不足，從而抑制了微生物的生長代謝，粗蛋白質(zhì)含量降低。因此，甘蔗糖蜜的最佳錘度為28°Bx。

2.6 菌種比例對粗蛋白質(zhì)含量的影響

在該發(fā)酵體系中，木霉與酵母有不同的分工，互補促進，多菌共同協(xié)作提高了對底物的利用率。酵母利用糖蜜中大量的碳源、氮源迅速生長繁殖，消耗大部分的糖類，解除了對木霉纖維素分解酶系的產(chǎn)物抑制作用。木霉在利用一小部分碳源供菌體生長后，將蔗葉纖維素分解為纖維二糖或葡萄糖，而酵母又可以利用這些糖類繼續(xù)合成菌體蛋白。在總接種量一定的條件下，將木霉與酵母按不同的比例接種，實驗結(jié)果如圖6所示，在木霉與酵母接種比例為1∶1時，粗蛋白質(zhì)含量最大；不斷加大酵母的接種量使得蛋白質(zhì)含量有增加的趨勢，但是大接種量造成營養(yǎng)供應(yīng)不足，影響酵母生長，粗蛋白質(zhì)含量無法達到最大值。

2.7 發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果

通過對上述單因素試驗，初步確定了木霉與酵母共同發(fā)酵的最優(yōu)條件。為了進一步確定各因素的最優(yōu)組合，以單因素實驗為依據(jù)，對固液比、接種量、溫度、糖蜜錘度進行正交試驗，其他條件均保持單因素優(yōu)化確定的最優(yōu)條件，利用Latin 3.1版設(shè)計正交試驗。表1為正交實驗設(shè)計，表2為正交實驗結(jié)果與極差分析，表3為方差分析。

表1 正交試驗因素和水平

根據(jù)正交設(shè)計試驗結(jié)果極差分析可以看出，四個因素的影響順序為：A＞C＞D＞B，即固液比＞溫度＞糖蜜錘度＞接種量，說明該發(fā)酵過程中，固液比對粗蛋白質(zhì)含量影響最大。最佳因素組合為A3B2C1D3，由正交表中結(jié)果可知，在固液比為1∶5、接種量為50%、溫度26℃、糖蜜錘度28°Bx的條件下，粗蛋白質(zhì)含量為正交表中最大值23.41%，比初始條件下的14.81%提高了8.6%。因此本實驗選擇固液比為1∶5、接種量為50%、溫度26℃、糖蜜錘度28°Bx為培養(yǎng)條件的最佳組合。

由于正交設(shè)計實驗中沒有空列，故將極差分析中極差最小項作為誤差列進行方差分析，由方差分析表（見表3）可知：因素A顯著，而因素C和D不顯著，因素的作用主次順序為A＞C＞D，與極差分析結(jié)果一致。

表2 發(fā)酵條件正交實驗結(jié)果

3 結(jié)論

①本實驗以甘蔗尾葉和甘蔗糖蜜為原料，利用木霉和酵母進行混合固態(tài)發(fā)酵，生產(chǎn)新型的高蛋白飼料，解決了蔗葉用于飼喂的若干問題，開拓了飼料來源的同時實現(xiàn)了糖業(yè)副產(chǎn)品的綜合利用。

表3 發(fā)酵條件正交試驗方差分析結(jié)果

②通過單因素試驗初步確定了培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)條件：糖蜜錘度28°Bx，其pH值為6.5，最優(yōu)固液比為1∶4，最適培養(yǎng)時間5 d，培養(yǎng)溫度為28℃，總菌接種量50%，接種比例1∶1。

③通過正交試驗進一步確定了最佳的條件組合：糖蜜錘度28 °Bx，其pH為6.5，最優(yōu)固液比為1∶5，最適培養(yǎng)時間5 d，培養(yǎng)溫度為26℃，總菌接種量50%，菌種比例1∶1。優(yōu)化的條件下發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量高達23.41%，較優(yōu)化前提高了8.6%。通過極差分析和正交分析可知，各因素的影響次序為：固液比＞溫度＞糖蜜錘度＞接種量，其中固液比對粗蛋白質(zhì)含量影響顯著。