韓雪 雷鵬 樵飛 吳先帆 赫佳康 劉蕾 胡彤 劉采云

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱150090）

通常發(fā)酵乳制品發(fā)酵過程中乳酸菌發(fā)酵占主導(dǎo)地位，但在許多傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品中卻都有酵母菌存在，并與乳酸菌共同作用組成復(fù)雜的菌系,如開菲爾乳中所用的開菲爾粒就是由多種酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵而成，發(fā)酵后的乳制品中含有大量黏性多糖、少量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等成分，賦予開菲爾特殊的酒香味和二氧化碳?xì)怏w，使其具有一般飲料所沒有的爽口感和風(fēng)味[1]；馬奶酒中酵母菌不僅參與酒精發(fā)酵，還具有抑制結(jié)核桿菌的作用[2]；在干酪成熟過程中酵母菌能夠利用乳酸提高其凝乳pH值，分解蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生多種水溶性維生素，抑制腐敗微生物和梭狀芽孢桿菌的生長[3]。這些由酵母菌與乳酸菌共同發(fā)酵制得的產(chǎn)品因其特殊的風(fēng)味及營養(yǎng)價值而深受世界各地人們喜愛。

酵母菌具有很高的營養(yǎng)價值，特別是含有較多蛋白質(zhì)，很多B族維生素、核酸和礦物質(zhì)，同時也能產(chǎn)生一些保健功能活性物質(zhì)。然而在酸奶中酵母菌的存在卻是不利的，往往被認(rèn)作酸奶中的污染菌，是酸奶變質(zhì)的主要原因。但在一些商業(yè)化的乳制品中，特定的酵母能夠為產(chǎn)品帶來期望的香氣和風(fēng)味。近年來，不斷發(fā)現(xiàn)酵母菌作為附屬發(fā)酵劑對乳制品發(fā)酵和成熟過程中的風(fēng)味影響、抑制有害菌的生長及對人體的潛在益生功能[4]。然而乳酸菌和酵母菌穩(wěn)定的互生關(guān)系比較復(fù)雜，既有促進作用也有抑制作用，對于不同產(chǎn)品中它們?nèi)绾蜗嗷プ饔?，會產(chǎn)生哪些影響及共生機理目前還不十分清楚。因此，探討乳酸菌與酵母菌的互作關(guān)系及其代謝產(chǎn)物的變化，有利于深入了解二者的生長和新陳代謝之間的相互影響，對開發(fā)乳酸菌與酵母菌共生性產(chǎn)品具有重要的實際應(yīng)用價值。

1.乳酸菌和酵母菌的互作關(guān)系

1.1 乳酸菌和酵母菌的協(xié)同作用

乳酸菌與酵母菌具有一定共生作用，而這種共生效果卻與培養(yǎng)溫度有著密切聯(lián)系。Gulloux等[5]對乳酸菌與酵母菌在變溫培養(yǎng)下的生長特性進行研究發(fā)現(xiàn)，在乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵乳制品過程中如果采用先30℃后37℃培養(yǎng)條件下，酵母菌首先旺盛生長，其代謝產(chǎn)物可供乳酸菌生長利用，之后轉(zhuǎn)到乳酸菌最適生長溫度 37℃條件下，乳酸菌利用這些營養(yǎng)物質(zhì)開始大量繁殖，此時乳酸菌菌數(shù)要比單獨乳酸菌發(fā)酵的活菌數(shù)明顯增多。而如果采用先37℃后30℃的培養(yǎng)方式，則乳酸菌在適宜的溫度37℃條件下首先旺盛生長，乳酸菌將乳糖分解成半乳糖和葡萄糖這些易于吸收的單糖，為酵母菌提供碳源，并為酵母菌提供一個適宜的pH生長環(huán)境，之后轉(zhuǎn)到酵母菌最適生長溫度30℃條件下，酵母菌開始大量繁殖，此時酵母菌菌數(shù)比單獨酵母菌發(fā)酵明顯增加。說明發(fā)酵乳培養(yǎng)溫度不同對乳酸菌及酵母菌活菌數(shù)的影響較大[5-7]。

董濤等[8]采用30℃對奶啤進行發(fā)酵發(fā)現(xiàn)加有乳酸菌的奶啤，酵母菌生長較單獨酵母菌發(fā)酵無論在發(fā)酵速度上還是酵母菌數(shù)上都有明顯提高。有研究表明將開菲爾粒中分離出的兩種異型乳酸桿菌與二種酵母菌再組合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩種乳酸菌的產(chǎn)酸性和生長繁殖性均受酵母菌促進,特別是當(dāng)具有發(fā)酵乳糖性質(zhì)的酵母菌存在時，乳酸菌產(chǎn)酸性能會大大增加，然而發(fā)酵乳中的乳酸含量和黏度卻降低，這可能是多種微生物在生長及代謝過程中的相互作用所致，其機理有待進一步研究[1,8,9]。此外利用酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵能夠有效降低牛奶中的脂肪含量，且利用兩種乳酸菌與一種酵母菌的混合發(fā)酵效果更顯著[10]。

1.2 乳酸菌和酵母菌的拮抗作用

Pablo研究中有些乳酸桿菌會受到假絲酵母、漢遜德巴利酵母、乳酸克魯維酵母、畢赤酵母四種酵母菌的抑制[11]。Nielsen的研究認(rèn)為乳酸菌和酵母菌混合培養(yǎng)的抑制作用主要表現(xiàn)在乳酸菌的生長受到由溶脂酵母新陳代謝產(chǎn)生的脂肪酸的抑制作用；乳酸菌產(chǎn)生的化合物如苯乳酸、4-羥基-苯乳酸、環(huán)肽抑制了酵母菌的生長[12]。乳酸菌和酵母菌的聯(lián)合培養(yǎng)可能與營養(yǎng)素的成長產(chǎn)生競爭作用或它們的新陳代謝的產(chǎn)物會抑制其他菌群的生長。目前乳酸菌與酵母菌在什么條件下或與何種種屬間有相互抑制及抑制機理還有待進一步研究。

2 乳酸菌與酵母菌共生機理

乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵制品是國內(nèi)學(xué)者研究的一個熱點。雖然共生機理還不十分明確，但目前對于乳酸菌與酵母菌相互利用代謝產(chǎn)物，及在信號分子水平和基因水平的研究已有初步結(jié)論。

2.1 互相利用代謝產(chǎn)物

Tamime與Marshall發(fā)現(xiàn)酵母菌和乳酸菌之間存在代謝產(chǎn)物互補機制，也就是說一種菌產(chǎn)生的物質(zhì)會被另一種菌代謝掉[13]。目前對于酵母菌通過代謝產(chǎn)物可促進乳酸菌生長的理論主要有四方面：一、乳酸菌是營養(yǎng)缺陷型菌株，酵母菌產(chǎn)生的大分子物質(zhì)能誘導(dǎo)乳酸菌中氨基肽酶合成,使培養(yǎng)液中氨基酸及小分子縮氨酸含量增加，從而促進乳酸菌的生長；二、酵母菌在發(fā)酵過程中水解乳中乳糖（某些水解乳糖酵母菌）、蛋白質(zhì)等為乳酸菌提供了許多營養(yǎng)因子，例如氨基酸,B族維生素和丙酮酸鹽等物質(zhì)，供乳酸菌生長所利用；三、酵母菌的酒精發(fā)酵或酵母菌自溶產(chǎn)生一定量的吡喃甘露糖，其可吸收中鏈脂肪酸，從而解除中鏈脂肪酸對乳酸菌的毒害作用，還有推測表明其可增加乳酸菌的α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙?；?葡萄糖脫水酶及肽酶的活性，從而間接地促進了乳酸菌的生長[6,7]；四、酵母菌本身含有種類齊全的氨基酸, 是良好的蛋白質(zhì)來源，可供乳酸菌生長利用。

而乳酸菌對于酵母菌生長的促進作用也存在三點，一、乳酸菌在發(fā)酵過程中水解乳中的乳糖、蛋白質(zhì)及脂肪,產(chǎn)生易于吸收的單糖、游離氨基酸和揮發(fā)性脂肪酸,以及多種維生素(B1、B2、B6、B12、葉酸等)這些小分子物質(zhì)為酵母菌的生長提供了豐富的營養(yǎng)來源[1]。二、乳酸菌代謝乳糖產(chǎn)生乳酸為酵母菌提供一個適宜的pH生長環(huán)境，從而促進酵母菌生長；三、乳酸菌的加入可促進酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生重要的風(fēng)味物質(zhì)乙醇、酸類及其他醇類物質(zhì),形成特有的酒香味。

2.2 信號分子水平

近年來的研究證明微生物之間存在信息交流，許多細(xì)菌都能合成并釋放一種被稱為自誘導(dǎo)物質(zhì)(autoinducer, AI)的信號分子，胞外的AI濃度能隨細(xì)菌密度的增加而增加，達(dá)到一個臨界濃度時，AI能啟動菌體中相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)菌的生物行為。

Guerzoni 等[14]在高酸（pH3.6），高氧（5mmol/LH2O2）及高滲透壓（40g/100mL 的蔗糖）的應(yīng)激條件下，研究乳酸菌與酵母菌單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)時產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)及乙醇的差異。結(jié)果表明應(yīng)激條件下乳酸菌及酵母菌共同培養(yǎng)可提高風(fēng)味及乙醇含量，其中乳酸菌在高氧環(huán)境下會產(chǎn)生較多的的γ- 癸內(nèi)酯，2( 5H)- 呋喃酮和乙醛；而在高酸環(huán)境下，酵母菌和乳酸菌都會大量積累乙酸、異戊酸及乙醇，其中酵母菌在高酸、高氧這種應(yīng)激條件下還會產(chǎn)生長鏈不飽和脂肪酸酯，這些應(yīng)激條件下產(chǎn)生的物質(zhì)被看作微生物在抗逆環(huán)境下產(chǎn)生的自身保護性物質(zhì)，而有學(xué)者則認(rèn)為這種在特定環(huán)境下釋放的物質(zhì)為信號分子[15]，且這些物質(zhì)為信號分子標(biāo)志。Losel等[16]報道了在研究雙孢蘑菇休眠時，其釋放的異戊酸就起著信號分子的作用。盡管目前對于微生物種內(nèi)及種間信號分子釋放的機理研究還不清楚，但通過研究微生物在應(yīng)激條件下分泌的代謝產(chǎn)物，有助于更好的了解乳酸菌與酵母菌之間的共生機制。

2.3 基因水平

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的革新，生物芯片技術(shù)為系統(tǒng)研究微生物菌群的關(guān)系提供了強有力的工具。Erasmus等認(rèn)為微生物菌體若在發(fā)酵過程中處于某種壓力環(huán)境下，那么其在轉(zhuǎn)錄時成百個隱性基因會被誘導(dǎo)為顯性基因表達(dá)出來[17]。Maligoy等研究了乳酸菌與酵母菌混合培養(yǎng)時在轉(zhuǎn)錄水平上乳酸菌菌體中表達(dá)基因的變化。結(jié)果表明酵母菌與乳酸菌混合培養(yǎng)時，負(fù)責(zé)代謝嘧啶的隱性基因比例較單獨菌株培養(yǎng)時低，從而導(dǎo)致三磷酸胞苷合成減少，進而促使負(fù)責(zé)三磷酸尿苷轉(zhuǎn)化為三磷酸胞苷的酶催化反應(yīng)的pyrG基因表達(dá)比例增高。根據(jù)DNA 芯片技術(shù)結(jié)果推測，乳酸菌與酵母菌混合培養(yǎng)時乙醇的積累是導(dǎo)致乳酸菌mRNA水平上負(fù)責(zé)各種新陳代謝途徑功能基因變化的主要原因。因此，在研究乳酸菌與酵母菌之間關(guān)系時可用酵母菌產(chǎn)的乙醇量作為重要指標(biāo)[18]。

目前許多乳酸菌與酵母菌共生機理還處在推測階段，但隨著對微生物代謝途徑的理解及現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，乳酸菌與酵母菌的共生機理勢將得以闡明，從而為更好的利用微生物資源開發(fā)新產(chǎn)品打下基礎(chǔ)。

3 乳酸菌與酵母菌發(fā)酵過程中的風(fēng)味代謝產(chǎn)物

3.1 乙醛含量的變化

賦予酸奶風(fēng)味的主要物質(zhì),是由乳酸菌利用蘇氨酸轉(zhuǎn)化而來的乙醛，但是乳酸菌的水解蛋白和脂肪能力較弱，更傾向于從牛乳蛋白中獲取必需氨基酸。

Rysstad[23]假設(shè)若酵母菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生蘇氨酸，則當(dāng)與乳酸菌混合培養(yǎng)時會提高產(chǎn)品中乙醛的含量。閆彬等[20]試驗得出乳酸菌可以利用蘇氨酸轉(zhuǎn)化生成乙醛，但乳酸菌水解蛋白能力較弱，而酵母菌水解蛋白能力較強，因此采用乳酸菌與酵母菌混合培養(yǎng)，可以提高乙醛的含量。結(jié)果表明酵母菌與乳酸菌混合培養(yǎng)物中乙醛含量顯著高于單菌培養(yǎng)的乙醛含量，這很好地印證了Rysstad的假設(shè)。但隨著培養(yǎng)時間延長，混合培養(yǎng)的乙醛含量低于單菌培養(yǎng)的乙醛含量，推測可能由于酵母菌將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇進而生成更多的麥芽芳香物質(zhì)。此外如采用有些異型發(fā)酵的乳酸菌也消耗部分乙醛，導(dǎo)致乙醛含量的降低。

3.2 氨基酸質(zhì)量濃度的變化

氨基酸主要包括一些小肽和游離氨基酸，游離氨基酸是影響發(fā)酵乳制品風(fēng)味的重要組成成分，其中許多小肽的風(fēng)味是由其末端的氨基酸決定的；由于高質(zhì)量濃度的游離氨基酸對感官有促進作用，總游離氨基酸質(zhì)量濃度與良好風(fēng)味的提高密切相關(guān)[19]。蛋白質(zhì)的水解作用主要歸于酵母菌的作用，而乳酸菌水解蛋白能力較弱。閆彬等[20]對內(nèi)蒙古錫盟地區(qū)酸馬奶中分離出的一株乳酸菌和一株酵母菌混合培養(yǎng)之后的游離氨基氮進行測定，得出在培養(yǎng)乳酸菌的脫脂乳培養(yǎng)基中，32h時雙菌培養(yǎng)基和單菌培養(yǎng)基中的游離氨基氮質(zhì)量濃度相當(dāng)，到36h由于雙菌共同利用基質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)使得游離氨基氮低于單菌培養(yǎng)基中產(chǎn)生的游離氨基氮。而在培養(yǎng)酵母菌的脫脂乳培養(yǎng)基中，至32h雙菌培養(yǎng)基中的游離氨基氮與單菌培養(yǎng)基中的相當(dāng)，并沒有明顯的減少，說明雙菌培養(yǎng)基中的小分子營養(yǎng)物質(zhì)較為豐富，促進了酵母菌的生長；到 36h雙菌培養(yǎng)基中的游離氨基氮質(zhì)量濃度略高于單菌培養(yǎng)基中產(chǎn)生的游離氨基氮[20]。該濃度的變化也暗示出乳酸菌與酵母菌之間存在共生相互關(guān)系。

3.3 丁二酮質(zhì)量濃度的變化趨勢

丁二酮是許多乳制品中的重要風(fēng)味物質(zhì),在乳品工業(yè)中具有很重要的應(yīng)用價值[21]。

雙菌培養(yǎng)基中產(chǎn)出風(fēng)味物質(zhì)丁二酮和乙酸、乳酸的的含量要高于單菌培養(yǎng)基中的產(chǎn)出量。劉慧[22]通過對乳酸菌與酵母菌分別進行單菌培養(yǎng)基和雙菌培養(yǎng)，得出在 0 ～24h單菌培養(yǎng)基與雙菌培養(yǎng)基中產(chǎn)出的丁二酮質(zhì)量濃度變化趨勢相當(dāng)，但至32h雙菌培養(yǎng)基中產(chǎn)出的丁二酮極顯著高于單菌培養(yǎng)基中的產(chǎn)出的丁二酮。原因是該試驗的酵母菌是克勒克氏酵母屬以產(chǎn)生檸檬酸為特點，而采用的乳酸菌為明串珠菌，屬異型乳酸，發(fā)酵可以進行檸檬酸代謝。乳酸菌通過利用檸檬酸經(jīng)一系列生化反應(yīng)可以合成丁二酮和乙酰甲基原醇[16]，因此采用可代謝檸檬酸的乳酸菌與產(chǎn)檸檬酸的酵母菌共同發(fā)酵，可促進產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生。

3.4 短鏈脂肪酸質(zhì)量濃度的變化

傳統(tǒng)發(fā)酵制品中含有的短鏈脂肪酸能促進腸道蠕動，從而改變滲透壓，有效清潔胃腸，清除體內(nèi)垃圾，防止便秘。同時抑制腐生菌在腸道的生長，進而抑制了腐敗菌所產(chǎn)生的毒素，減少其對機體組織的損壞，達(dá)到美容養(yǎng)顏，防癌抗癌，延年益壽的效果。

乙酸是許多發(fā)酵奶制品重要的風(fēng)味物質(zhì)，并且它與檸檬酸代謝有關(guān)，是乳酸菌通過分解檸檬酸得來的[24]。在乳酸菌與酵母菌共培養(yǎng)的乳中，酵母菌可產(chǎn)生檸檬酸，而乳酸菌還可以進行檸檬酸代謝，從而使雙菌共培養(yǎng)的發(fā)酵乳產(chǎn)生特有的風(fēng)味[20,24]。

4 展望

發(fā)酵乳制品中酵母菌和乳酸菌的關(guān)系比較復(fù)雜，他們之間既有抑制作用又有促進作用，盡管國內(nèi)外關(guān)于乳酸菌與酵母菌共生機理的研究還不十分清楚，但是相信隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的飛速發(fā)展，16S rRNA 基因序列分析、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)等一些技術(shù)的應(yīng)用將會在研究環(huán)境微生物生態(tài)系統(tǒng)組成結(jié)構(gòu)、功能的分子機理以及微生物之間相互關(guān)系等方面顯示出巨大的潛力，也將對我們深入研究二者的共生機理提供出新的思路和方法，從而為今后開發(fā)和研制出更多發(fā)酵制品提供重要的科學(xué)依據(jù)，并給發(fā)酵制品工業(yè)化的生產(chǎn)與發(fā)展打下堅實的基礎(chǔ)。

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