李 娟 劉風(fēng)林 張書(shū)紅

我國(guó)是人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染的高發(fā)流行地區(qū)[1]。除先天性感染外，經(jīng)產(chǎn)道傳播、母乳傳播、家庭內(nèi)傳播亦是嬰幼兒感染HCMV的重要途徑[2]。HCMV感染臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，且存在潛伏性感染，從輕微無(wú)癥狀感染直到嚴(yán)重缺陷或死亡。因而早期診斷、早期治療對(duì)預(yù)后至關(guān)重要。但目前DNA-PCR檢測(cè)HCMV只能證明病毒存在，并不能反映病毒復(fù)制。HCMV基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IE mRNA及pp67 mRNA的檢測(cè)已應(yīng)用于器官移植后患者是否存在HCMV活動(dòng)性感染的早期診斷[3-4]，并已作為HCMV宮內(nèi)活動(dòng)性感染的特異性指標(biāo)[5]，但尚少見(jiàn)針對(duì)嬰幼兒HCMV感染者的研究。本研究擬通過(guò)對(duì)HCMV基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IE mRNA和pp67 mRNA的檢測(cè)，探討mRNA表達(dá)是否可以作為嬰幼兒HCMV感染的診斷方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年5月—2011年11月我院消化科收治的以黃疸、肝脾腫大、發(fā)熱、咳喘、腹瀉、抽搐為主要癥狀的1～6個(gè)月患兒。入院后行肝功能，血、尿、痰CMV-DNA，CMV-IgM，CMVpp67檢測(cè)。選擇結(jié)果滿(mǎn)足血、尿、痰CMVDNA拷貝數(shù)增高、血CMV-IgM、CMVpp67檢測(cè)呈陽(yáng)性中任意一項(xiàng)同時(shí)除外其他病毒感染者入陽(yáng)性組，共105例。并進(jìn)一步行頭CT、聽(tīng)力及眼底檢查，綜合臨床癥狀體征及各項(xiàng)檢查結(jié)果做出判斷。而血、尿、痰CMV-DNA拷貝數(shù)增高，血CMV-IgM、CMVpp67檢測(cè)均呈陰性,同時(shí)除外其他病毒感染者列入陰性組，共98例。2組間月齡、性別和體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

Tab.1 General information of infants who were either positive or negative of CMV infection with current clinic diagnosis standards表1 陽(yáng)性組與陰性組患兒一般情況比較

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 RNA抽提試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量（real-time）PCR反應(yīng)試劑盒（QIAGEN，Germany）。Real-time PCR儀及數(shù)據(jù)分析軟件（ABI 7500，Life Technologies，US）。

1.3 方法

1.3.1 生化指標(biāo)的檢測(cè) 所有患兒抽取股靜脈血1～2 mL，TBIL、DBIL、ALT及ALP指標(biāo)均采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，而HC?MV-DNA則采用裂解液破碎細(xì)胞，使得病毒顆粒游離，然后14 000×g離心10 min，取上清，利用熒光定量方法對(duì)病毒DNA拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.3.2 cDNA的合成 參照參考文獻(xiàn)[4]，采用Trizol方法抽提血清樣本總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度與純度，檢測(cè)光密度（OD）260/OD280數(shù)值在1.8～2.0之間時(shí)，證明提取的RNA純度適合于進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。4 μg總RNA于80μL反應(yīng)體系，混勻后，1 000 r/min離心30 s，65℃水浴5 min后立即置于冰浴1 min。1 000 r/min離心30 s，冰浴中依次加入：5×First-strand buffer，0.1 mol/L MDTT，RNase抑制劑（40 U/μL）?；靹?，25℃孵育10 min，37℃孵育2 min。各管中分別加入4μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200 μL），混勻后短暫離心，37℃水浴50 min。70℃水浴15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶活性終止反應(yīng)，–20℃保存樣品cDNA。

1.3.3 Real-time PCR 試驗(yàn)流程參照參考文獻(xiàn)[4]。IE及pp67基因的PCR引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性60 s；95 ℃ 10 s、退火溫度58 ℃ 10 s、72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溫度變化速度為20℃/s，在每個(gè)循環(huán)的延伸末檢測(cè)熒光信號(hào)。隨后是一個(gè)緩慢升溫的程序：65℃15 s，95℃10 s，溫度變化速度為0.1℃/s，同時(shí)連續(xù)檢測(cè)DNA逐漸變化過(guò)程中熒光信號(hào)的變化情況，繪制PCR產(chǎn)物的熔解曲線（melting curve），以了解樣品擴(kuò)增的特異性，保障測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。本研究中將各待測(cè)基因的PCR擴(kuò)增CT值與相對(duì)應(yīng)的βactin的PCR擴(kuò)增CT值相減得到△CT來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以2-△CT計(jì)算得出各待測(cè)基因產(chǎn)物的相對(duì)定量，每管樣品重復(fù)測(cè)定3次。根據(jù)基因相對(duì)表達(dá)量，樣本IE及pp67的相對(duì)表達(dá)數(shù)值高于對(duì)照組5倍以上被認(rèn)為是高表達(dá)，5倍以下被認(rèn)為是低表達(dá)。

Tab.2 Primers for real-time PCR表2 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基線資料 傳統(tǒng)方法檢測(cè)TBIL、DBIL、ALT、ALP和HCMV-DNA拷貝數(shù)陽(yáng)性組均高于陰性組（P＜0.01），見(jiàn)表1。

2.2 IE mRNA及pp67mRNA在常規(guī)診斷HCMV陽(yáng)性和陰性患兒中的表達(dá) 常規(guī)診斷的陰性組中亦有IE mRNA陽(yáng)性表達(dá)患者，但陽(yáng)性率顯著低于陽(yáng)性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表3。

Tab.3 IE and pp67 transcription in the infants who were CMV positive with current clinic standards表3 2組間IE及pp67 mRNA陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果例（%）

2.3 IE及pp67 mRNA表達(dá)在常規(guī)診斷HCMV陽(yáng)性患兒中的分布規(guī)律 105例陽(yáng)性患兒中，72例IE高表達(dá)，33例IE低表達(dá)。IE與pp67表達(dá)呈現(xiàn)交錯(cuò)進(jìn)行的表達(dá)趨勢(shì)，即IE表達(dá)升高，pp67表達(dá)呈現(xiàn)較低的狀態(tài)，見(jiàn)表4。

2.4 IE及pp67 mRNA表達(dá)在常規(guī)診斷HCMV陰性患兒中的分布規(guī)律 HCMV陰性組患兒中盡管也檢測(cè)到IE的表達(dá)（0.23±0.03），但是表達(dá)量顯著低于IE低表達(dá)組（1.03±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.215，P＜0.05）。陰性組患兒未檢測(cè)到pp67的表達(dá)。

Tab.4 Relative mRNA transcription profile of IE and pp67 genes in the HCMV-positive samples diagnosed by routine method表4 陽(yáng)性組患兒中IE及pp67基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

本研究主要對(duì)來(lái)我院就診的常規(guī)診斷HCMV陽(yáng)性或陰性患兒血液中的HCMV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，病毒轉(zhuǎn)錄早期和晚期的mRNA均在陽(yáng)性患兒中表達(dá)，部分患兒就診時(shí)體內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)pp67 mRNA表達(dá)，提示已經(jīng)處于病毒感染晚期。在傳統(tǒng)檢測(cè)陰性的患兒中，筆者也檢測(cè)到有IE mRNA的表達(dá)，說(shuō)明現(xiàn)有診斷方法的靈敏度不足，提示這部分患兒也應(yīng)該進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委煛?/p>

目前我國(guó)嬰幼兒感染HCMV的傳統(tǒng)診斷方法是基礎(chǔ)病毒DNA擴(kuò)增的檢測(cè)手段，判斷是否感染該病毒。但是傳統(tǒng)的DNA擴(kuò)增手段只能通過(guò)明確基因拷貝數(shù)的多少來(lái)判斷感染情況，對(duì)于早期感染及病毒復(fù)制情況，并無(wú)法進(jìn)行有效地判斷，影響了疾病的治療。因此，目前開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)手段是國(guó)際該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-6]。

在既往研究中，IE mRNA和pp67 mRNA檢測(cè)已經(jīng)在腎臟移植后是否出現(xiàn)HCMV感染鑒定中被應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，IE mRNA出現(xiàn)時(shí)間顯著早于pp67 mRNA，提示IE mRNA是早期發(fā)現(xiàn)HCMV感染，并作出診療方案的重要依據(jù)[7]。同時(shí)，Pairoj等[8]發(fā)現(xiàn)，利用PCR方法檢測(cè)pp67的表達(dá)，較傳統(tǒng)的DNA-PCR方法更為敏感。Bergallo等[9]發(fā)現(xiàn)利用熒光定量PCR在HCMV-DNA拷貝數(shù)在100個(gè)時(shí)即可檢測(cè)到。上述研究結(jié)果與筆者的結(jié)果是一致的，表明mRNA檢測(cè)對(duì)于判斷HCMV感染更加準(zhǔn)確和靈敏。但不同的是，本研究利用了兩種mRNA共表達(dá)的檢測(cè)手段，通過(guò)分析每一種mRNA的相對(duì)表達(dá)量，達(dá)到更加準(zhǔn)確地判斷HCMV感染時(shí)期的目的。

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