王柏強(qiáng)，劉福，江承平，何效平，曾芝蘭（.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川南充 637000）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）是我國特有的名貴中藥材，傳統(tǒng)用藥以皮為主，但剝皮后樹體容易死亡?，F(xiàn)代研究表明，杜仲葉與皮所含化學(xué)成分基本相同[1]，且葉中部分有效成分比皮還要高[2]。杜仲葉具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用，用于治療肝腎不足、頭暈?zāi)垦?、腰膝酸痛、筋骨痿軟等證[3]。本研究在眾多理論基礎(chǔ)上，采用超聲聯(lián)合纖維素酶法提取杜仲葉綠原酸，通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)提取工藝。因杜仲葉中的有效成分主要存在于細(xì)胞壁包被的葉細(xì)胞內(nèi)[4]，故首先用纖維素酶水解杜仲葉細(xì)胞壁，再聯(lián)合超聲輔助提取法對杜仲葉綠原酸進(jìn)行高效提取，最大限度地利用杜仲葉資源，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

10 A型高效液相色譜儀，包括SPD-10A型紫外檢測器（日本島津公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；PHS-SB型pH計(jì)（成都瑞馳分析控制儀器有限公司）；760型CRT雙光束紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；TP-114型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；SB-25-12DT型超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥材

杜仲葉，購自重慶醫(yī)藥公司，經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李生茂講師鑒定為真品。

1.3 試劑

纖維素酶（上海伯奧生物科技有限公司，活性：≥15 U/mg）；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：0753-200111）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸含量的測定

2.1.1 色譜條件色譜柱：Hypersic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：327 nm；柱溫：室溫。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的綠原酸對照品13 mg，置100 ml量瓶中以50%甲醇溶解并定容至刻度，即得0.13 mg/ml對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉末10 g，加入pH4 NaAc-HAc緩沖液120 ml、纖維素酶20 mg，置40℃水浴中酶解30 min后再于50℃超聲提取30 min，濾過，精密吸取濾液0.5 ml，置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀釋并定容至刻度，0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對照品溶液1、3、5、8、10 ml，置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積值積分值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝31 860c+27 633（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，綠原酸質(zhì)量濃度在1.3～130μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.2 不同提取方法比較[5-8]

準(zhǔn)確稱取杜仲葉粉末10 g，采用不同溶劑、不同提取方法進(jìn)行考察。采用乙醇超聲提取法和超聲纖維素酶法所得的綠原酸提取率相對較高，但乙醇超聲提取需要有機(jī)溶劑，生產(chǎn)成本高；而采用超聲纖維素酶法提取，更節(jié)省能源，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。不同提取方法比較結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法比較（n＝3）Tab 1 Comparison of different extraction methods（n＝3）

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 酶解pH考察 適當(dāng)?shù)膒H可維持酶活性中心最佳構(gòu)象，促進(jìn)酶與底物結(jié)合；pH不同會導(dǎo)致酶與作用底物所帶電荷不同，使得酶與底物的親和力不同，從而催化速度也不同。由考察結(jié)果可知，在pH＝4.5時(shí)，綠原酸提取率最高，隨著pH再升高，綠原酸的提取率逐漸下降。酶解pH對綠原酸提取率的影響見圖1。

圖1 酶解pH對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 1 Effects of pH of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.2 酶解時(shí)間考察 酶解時(shí)間與酶促反應(yīng)進(jìn)行程度密切相關(guān)，反應(yīng)時(shí)間太短，酶解不充分。在考察范圍內(nèi)隨著酶解時(shí)間的增加，綠原酸的提取率呈逐漸增加的趨勢。當(dāng)綠原酸提取率達(dá)到一定值后，酶促反應(yīng)時(shí)間的延長并不能明顯增加提取率。為節(jié)省時(shí)間，選擇酶解時(shí)間為60 min。酶解時(shí)間對綠原酸提取率的影響見圖2。

2.3.3 酶解溫度考察 隨著酶解溫度升高綠原酸提取率逐漸增大，達(dá)到40℃后繼續(xù)升高溫度，綠原酸提取率反而呈現(xiàn)不同程度的下降。主要原因是酶促反應(yīng)中，合適的溫度能使酶保持最大活性，同時(shí)也有利于提取介質(zhì)擴(kuò)散；溫度過高，不僅導(dǎo)致綠原酸氧化分解，也會使酶蛋白變性。所以，提取溫度在30～50℃之間較為適宜。酶解溫度對綠原酸提取率的影響見圖3。

圖2 酶解時(shí)間對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 2 Effects of time of Enzymatic hydrolysis of pH on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

圖3 酶解溫度對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 3 Effects of temperature of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.4 酶用量考察 隨著纖維素酶用量的增加，綠原酸提取率明顯增加，當(dāng)酶的用量增加到20 mg時(shí)，酶分子逐漸趨于飽和，提取液中綠原酸的含量增加速度變慢。酶用量對綠原酸提取率的影響見圖4。

圖4 酶用量對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 4 Effects of consumption of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.5 固液比考察 固液比過小時(shí)，溶液黏度大、濾過困難；在固液比為1∶15（g/ml）時(shí)，綠原酸提取率最大，而固液比過大，導(dǎo)致體系中酶的濃度降低，影響綠原酸提取效果，同時(shí)濾過費(fèi)時(shí)，還會給后續(xù)純化工藝帶來困難。固液比對綠原酸提取率的影響見圖5。

圖5 固液比對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 5 Effects of the ratio of solid to liquid on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.6 超聲提取時(shí)間考察 超聲提取初期，綠原酸提取率隨著超聲時(shí)間的延長而逐漸升高，至超聲處理40 min時(shí)，綠原酸提取率達(dá)最大值，而后綠原酸含量隨時(shí)間的延長逐漸降低。超聲提取時(shí)間對綠原酸提取率的影響見圖6。

圖6 超聲提取時(shí)間對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 6 Effects of dosage of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.7 超聲提取溫度考察 超聲提取溫度對綠原酸提取率影響也較大，隨溫度的升高，綠原酸提取率呈增加趨勢，同時(shí)雜質(zhì)溶出量也相應(yīng)增大，溫度過高活性成分易被破壞。為了避免長時(shí)間高溫下綠原酸被氧化分解，以及提高提取操作效率，超聲提取溫度在50℃左右較為適宜。超聲提取溫度對綠原酸提取率的影響見圖7。

圖7 超聲提取溫度對綠原酸提取率的影響（n＝3）Fig 7 Effects of dosage of ultrasonic extraction temperature on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

在單因素考察基礎(chǔ)上，以超聲提取時(shí)間（A）、固液比（B）、酶解溫度（C）、酶用量（D）為考察因素，綠原酸提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平見表2；正交試驗(yàn)結(jié)果見表3；方差分析結(jié)果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

由表3、表4可以看出，4個(gè)因素對綠原酸提取率的影響趨勢與單因素考察結(jié)果基本一致，因素影響的大小為固液比＞超聲提取時(shí)間＞酶解溫度＞酶用量。在考察范圍內(nèi)，就綠原酸提取率而言，固液比與超聲提取時(shí)間為顯著性影響。根據(jù)正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果確定最佳工藝條件為A2B2C3D2，即超聲提取時(shí)間40 min，固液比1∶15（g/ml），酶解溫度45 ℃，酶用量20 mg。

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為考察最佳工藝條件的重現(xiàn)性，按最佳工藝條件重復(fù)試驗(yàn)6次。結(jié)果，綠原酸的平均提取率為2.37%，RSD＝2.8%（n＝6），說明優(yōu)選的工藝合理、可行，重現(xiàn)性較好。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

3 討論

筆者對不同提取方法與不同提取溶劑進(jìn)行初步考察發(fā)現(xiàn)，以乙醇超聲提取法和超聲纖維素酶法中綠原酸提取率相對較高。乙醇回流提取雜質(zhì)多[5]，不易濾過，且溫度高，加熱時(shí)間長，易使綠原酸氧化分解。水回流提取法的不足之處在于提取溫度比醇提法更高，濾過分離困難，綠原酸含量也比醇提法偏低。超聲纖維素酶法與乙醇超聲提取法比較，更節(jié)省能源，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。

超聲纖維素酶法提取可從多方面促進(jìn)綠原酸的提取，首先運(yùn)用纖維素酶破壞細(xì)胞壁中的纖維素[9]，以加快杜仲葉有效成分的釋放，利于提取分離。其次，利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度，可增大介質(zhì)的穿透力以提取中藥有效成分。綜上，筆者優(yōu)選的工藝不但可提高綠原酸提取率，更重要的是大大節(jié)約了能源，由于所用的酶安全、廉價(jià)，同時(shí)工藝還具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等特點(diǎn)，為杜仲葉綠原酸的工業(yè)化提取奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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