謝利霞，趙飛宇，周 蓓，楊萬(wàn)章（廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 518052）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種常見(jiàn)中老年人的慢性進(jìn)展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其病變與患者黑質(zhì)紋狀體多巴胺（DA）能神經(jīng)元大量死亡，導(dǎo)致紋狀體缺乏大量DA有關(guān)[1]。左旋多巴為擬多巴胺類(lèi)抗帕金森病藥，本身并無(wú)藥理活性，通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞，經(jīng)多巴脫羧酶作用轉(zhuǎn)化成DA而發(fā)揮藥理作用，改善帕金森病癥狀。左旋多巴一直是治療帕金森病的最有效藥物，被譽(yù)為PD治療藥物的“金標(biāo)準(zhǔn)”。中藥丹參Salvia miltiorrhizabge.為唇形科鼠尾草屬植物，其根可入藥。其活性成分具有抗氧化作用，文獻(xiàn)報(bào)道丹參素對(duì)缺糖-缺氧損傷后神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）細(xì)胞的凋亡過(guò)程具有抑制作用，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[2]，同時(shí)也有研究表明丹酚酸B可抑制6羥基多巴胺（6-OHDA）導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[3]。

研究顯示，魚(yú)藤酮是繼1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）之后所發(fā)現(xiàn)的第二個(gè)導(dǎo)致多巴胺（DA）神經(jīng)元退變的外源性化合物。因此，魚(yú)藤酮作為一種誘發(fā)PD的環(huán)境因素成為近來(lái)研究PD病因的熱點(diǎn)之一。褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤株（PC12）細(xì)胞因其在形態(tài)、生理、生化等功能特別是膜受體及遞質(zhì)合成上與中腦DA能神經(jīng)元十分接近而被視為體外替代DA能神經(jīng)元較好的細(xì)胞模型[4-5]。因此，本研究選擇PC12細(xì)胞作為魚(yú)藤酮體外DA能神經(jīng)元毒性作用的研究模型。

筆者以前的研究表明，魚(yú)藤酮可導(dǎo)致分化PC12細(xì)胞凋亡[6-7]。本研究通過(guò)水溶性四氮唑（WST-1）法和Hoechst 33342標(biāo)記染色法同樣驗(yàn)證了上述結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)左旋多巴和丹參聯(lián)合作用可明顯提高分化PC12細(xì)胞增殖率。

上述研究提示左旋多巴與丹參在治療PD中具有潛在互補(bǔ)機(jī)制，聯(lián)合用藥的功效與機(jī)制有待進(jìn)一步探討。本研究選用左旋多巴與丹參注射液聯(lián)用為研究對(duì)象，采用魚(yú)藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡作為PD體外模型，運(yùn)用WST-1法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)增殖率，免疫印跡（ELISA）法檢測(cè)3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）蛋白含量與20S蛋白酶體（PSM）活性，進(jìn)而研究左旋多巴聯(lián)合丹參注射液對(duì)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的分化PC12細(xì)胞的影響，探討其作用機(jī)制，為中西醫(yī)結(jié)合治療PD提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DFM80C型熒光顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器廠）；ELx800NB型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；3K15型離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

丹參注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1203301，規(guī)格：10 ml/支，每 1 ml含原兒茶醛不低于0.2 mg）；DMEM/F12培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；魚(yú)藤酮、碘化丙啶（PI）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Hoechst 33432染色液（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；WST-1試劑、左旋多巴（美國(guó)羅氏公司）；人3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，上海亞培生物科技有限公司）；人20S蛋白酶（20S PSM）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞瘤株

PC12購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

DMEM培養(yǎng)基加體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清（FBS）、青霉素1×105u/L、慶大霉素8×104u/L，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞增長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用含0.1 g/L二胺二乙酸二鈉鹽的0.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，1∶5分瓶傳代，每4 d傳代1次，細(xì)胞每隔1 d換1次液。

2.2 復(fù)制模型與分組、給藥

魚(yú)藤酮（50 μmol/L）培養(yǎng)細(xì)胞24 h以復(fù)制PC12細(xì)胞凋亡模型。實(shí)驗(yàn)分為7組，即正常對(duì)照（正常細(xì)胞，等容培養(yǎng)液）組、聯(lián)合用藥對(duì)照（正常細(xì)胞，左旋多巴2 μmol/L+丹參注射液3.125 μg/ml）組、模型（模型細(xì)胞，等容培養(yǎng)液）組、NGF（模型細(xì)胞，300 μg/L）組、左旋多巴（模型細(xì)胞，2 μmol/L）組、丹參注射液（模型細(xì)胞，3.125 μg/ml）組、聯(lián)合用藥（模型細(xì)胞，左旋多巴2 μmol/L+丹參注射液3.125 μg/ml）組。復(fù)制模型前6 h開(kāi)始用藥培養(yǎng)細(xì)胞，連續(xù)6 h。

2.3 WST-1實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)分化的PC12細(xì)胞，以每孔1×105細(xì)胞密度種于96孔板中，于培養(yǎng)箱中孵育24 h（在96孔板中長(zhǎng)至大于90%），孵育細(xì)胞，加10 μl WST-1孵育1 h，在酶標(biāo)儀450/690 nm雙波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD）。實(shí)驗(yàn)另設(shè)空白對(duì)照（無(wú)細(xì)胞，僅含培養(yǎng)液）和背景對(duì)照（含細(xì)胞，但不含WST-1，對(duì)照孔OD應(yīng)小于011）。按標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組均值/正常對(duì)照組均值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為0級(jí)或1級(jí)反應(yīng)是合格；實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2級(jí)反應(yīng)的，應(yīng)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)分析，綜合評(píng)價(jià)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3～4級(jí)反應(yīng)是不合格。細(xì)胞毒性分級(jí)為0～4級(jí)，其細(xì)胞相對(duì)增殖率由小到大分別為≥100%、75%～99%、50%～74%、25%～49%、0～24%。

2.4 Hoechst 33342核染色分析

將各組細(xì)胞棄除培養(yǎng)基，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L多聚甲醛在室溫下固定30 min，棄固定液后PBS（pH7.2）洗3遍，10 mg/L Hoechst 33342室溫避光染色10 min，熒光顯微鏡下觀察染色質(zhì)形態(tài)。

2.5 GAPDH蛋白含量的測(cè)定

收集各組細(xì)胞，提取總蛋白。將定量后的蛋白樣品（每孔20 μg）上樣于聚丙烯酰氨凝膠（SDS-PAGE）小孔，100 V電泳1 h，300 mA下轉(zhuǎn)膜1.5 h。將轉(zhuǎn)好的硝酸纖維素膜用封閉液室溫振蕩封閉2 h，然后加入1∶500（V/V）GAPDH一抗，37 ℃孵育2h，TBS漂洗15 min×3次，再加入1∶2 000（V/V）辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，TBS漂洗15 min×3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑顯影，膠片曝光。結(jié)果用UVP掃描儀掃描成像。

2.6 20S PSM表達(dá)的測(cè)定

各組藥物，棄除原培養(yǎng)液，用1×PBS清洗1次，在冰上操作，常規(guī)胰酶消化細(xì)胞，4℃下以離心半徑為5.0 cm、1000 r/min離心20 min，沉淀加入用蛋白提取液[10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.8，0.5 mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），5 mmol/L 三磷酸腺苷（ATP），0.035%SDS，5 mmol/L MgCl2100 μl]超聲勻漿，采用BCA法測(cè)定蛋白含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)將樣品稀釋成1 μg/μl，37 ℃下2.5 μl LLVY-AMC（5 mmol/L）避光反應(yīng)1 h后，在連續(xù)波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀上讀數(shù)。結(jié)果，激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為410 nm。以空白對(duì)照組與背景對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)零。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞增殖率的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，NGF組、左旋多巴組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖率升高（P＜0.01或P＜0.05）。聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞增殖率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞增殖率的影響Fig 1 Effects of drug combination on the proliferation rate in model cells

3.2 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色分化PC12細(xì)胞后，未呈現(xiàn)毒性，細(xì)胞無(wú)污染、過(guò)度死亡、衰老和分化等情況。細(xì)胞染色后，立即用倒置相差熒光顯微鏡觀察，在紫外光激發(fā)下，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。與正常對(duì)照組比較，模型組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；與模型組比較，聯(lián)合用藥組熒光強(qiáng)度減弱，且效果好于左旋多巴組。聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞凋亡的影響見(jiàn)圖2。

3.3 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞GAPDH蛋白含量的影響

圖2 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Effects of drug combination on apoptosis in model cells

魚(yú)藤酮處理后細(xì)胞內(nèi)GAPDH蛋白均隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈增加；而隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，GAPDH的糖酵解酶活性反而下降；亞細(xì)胞組分的分離及ELISA進(jìn)一步證實(shí)，魚(yú)藤酮處理后GAPDH主要在細(xì)胞核及線粒體組分內(nèi)增多。根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度及其對(duì)應(yīng)的OD，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)測(cè)量的各組樣品的吸光度A450計(jì)算出各GAPDH質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示，50 μmol/L魚(yú)藤酮作用分化PC12細(xì)胞24 h，GAPDH蛋白含量明顯增加，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)合用藥組GAPDH蛋白含量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），且效果好于左旋多巴組。聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞GAPDH蛋白含量的影響見(jiàn)表1[OD小于空白OD（0.0603）的樣品表示GAPDH質(zhì)量濃度過(guò)低均按0 ng/ml處理]。

表1 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞GAPDH含量的影響（±s，n＝6）Tab 1 Effects of drug combination on the content of GAPDH in rotenone-induced differentiated PC12 cell（s±s，n＝6）

表1 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞GAPDH含量的影響（±s，n＝6）Tab 1 Effects of drug combination on the content of GAPDH in rotenone-induced differentiated PC12 cell（s±s，n＝6）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組NGF組左旋多巴組丹參注射液組聯(lián)合用藥對(duì)照組聯(lián)合用藥組GAPDH，ng/ml 0 5.48±0.13＊1.38±0.21##2.43±0.24#3.41±0.39 0 1.19±0.08##

3.4 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞20S PSM活性的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)20S PSM活性減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，聯(lián)合用藥組細(xì)胞內(nèi)20S PSM活性增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且效果好于左旋多巴組。聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞20S PSM活性的影響見(jiàn)表2。

表2 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞20S PSM活性的影響（±s，n＝6）Tab 2 Effects of drug combination on the activity of 20S PSM in model cell（s±s，n＝6）

表2 聯(lián)合用藥對(duì)模型細(xì)胞20S PSM活性的影響（±s，n＝6）Tab 2 Effects of drug combination on the activity of 20S PSM in model cell（s±s，n＝6）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組NGF組左旋多巴組丹參注射液組聯(lián)合用藥對(duì)照組聯(lián)合用藥組PSM，U/L 975.7±112.3 377.2±89.4＊797.2±103.1#696.2±104.8 577.2±98.1 953.4±121.6 882.2±134.8#

4 討論

本研究以魚(yú)藤酮作為誘導(dǎo)劑，通過(guò)WST-1細(xì)胞增殖率檢測(cè)法和Hoechst 33342標(biāo)記染色法再次驗(yàn)證上述結(jié)果，即魚(yú)藤酮可導(dǎo)致分化PC12細(xì)胞凋亡[6]。并發(fā)現(xiàn)左旋多巴和丹參聯(lián)合作用較左旋多巴或丹參單獨(dú)作用更能提高分化PC12細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞、動(dòng)物模型、流行病學(xué)研究以及臨床病例報(bào)道魚(yú)藤酮等是常見(jiàn)的與PD發(fā)病相關(guān)的神經(jīng)毒素，在這些神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡過(guò)程中均檢測(cè)到GAPDH基因過(guò)度表達(dá)、GAPDH酶蛋白異常聚集和核轉(zhuǎn)位，說(shuō)明GAPDH基因過(guò)表達(dá)、GAPDH酶蛋白異常聚集和核轉(zhuǎn)位是PD發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[7-10]。眾所周知，PD典型的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其病理性標(biāo)志是路易小體（LB），它是一種嗜酸性蛋白包涵體，主要的蛋白成分包括α-synuclein、泛素、PSM亞單位、泛素羥基末端水酶（UCH-L1）、Parkin等，所以近來(lái)（UPS）在PD發(fā)病機(jī)制中的作用成為研究熱點(diǎn)[11]。有研究表明，PSM抑制劑Lactacystin在環(huán)境中廣泛存在，當(dāng)易感人群通過(guò)生活接觸、飲食等方式將其攝入體內(nèi)時(shí)，抑制了20S/26S PSM功能，致使UPS功能缺陷。在這種情況下，錯(cuò)誤折疊、突變及損傷的蛋白質(zhì)（主要包括α-synuclein）得不到有效降解而在細(xì)胞內(nèi)堆積，會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平的上升。當(dāng)異常、突變、氧化修飾的蛋白超過(guò)了細(xì)胞的降解能力或者UPS本身功能受損都可以導(dǎo)致這些蛋白聚集，而聚集體內(nèi)成分α-synuclein過(guò)度表達(dá)或突變也能削弱UPS的功能，UPS功能缺失致蛋白聚集，最終導(dǎo)致PD的發(fā)生[12]。文獻(xiàn)報(bào)道，20S PSM是診斷PD的潛在生物標(biāo)記物之一，能為早期診斷PD提供一定幫助[13]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，魚(yú)藤酮作用于分化PC12細(xì)胞，可顯著降低20S PSM含量，從而影響PSM功能。傳統(tǒng)化學(xué)藥左旋多巴可在一定程度上緩解魚(yú)藤酮所致的分化PC12細(xì)胞20S PSM活性減弱，但左旋多巴和丹參注射液的聯(lián)合應(yīng)用可明顯增強(qiáng)PC12細(xì)胞20S PSM活性。

綜上所述，左旋多巴和丹參注射液聯(lián)合用藥通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)GAPDH含量及增強(qiáng)20S PSM活性途徑拮抗魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的分化PC12細(xì)胞凋亡，其效果優(yōu)于左旋多巴單用，這一結(jié)果可為中西醫(yī)結(jié)合治療PD患者提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

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