賀 琴 李德梅 李敬會(huì) 譚華炳 (湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院感染性疾病科，湖北 十堰 442000)

我國已成為僅次于印度的糖尿病第二大國，預(yù)計(jì)到2025年兩國將各有2億人口罹患糖尿病〔1〕，其中95%為2型糖尿病(T2DM)。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是脂肪肝(FLD)主要類型。NAFLD已成為發(fā)達(dá)國家和地區(qū)第一大肝病，在我國亦可能成為慢性肝病的首要病因〔2〕。T2DM患者NAFLD檢出率為 50.45%〔3〕;NAFLD 導(dǎo) 致 T2DM〔4～6〕;說 明 T2DM 與NAFLD互為因果。絞股藍(lán)及絞股藍(lán)皂苷(GPS)能降低NAFLD兔肝臟脂質(zhì)沉積量〔7〕，有治療 T2DM、代謝綜合征作用〔8，9〕。本研究通過高脂飼料飼養(yǎng)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)注射建立T2DM并NAFLD模型，觀察GPS對(duì)T2DM并NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)沉積量影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及場地 65只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供〔合格證號(hào):No.scxk(湘)2009-0004〕。實(shí)驗(yàn)場地湖北省十堰市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明號(hào):00015644)。

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料 普通飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。膽固醇購自北京雙旋生物培養(yǎng)基制品廠。豬油由市售板油自行煉制而成，蛋黃粉由市售雞蛋自行制作。高糖高脂飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心按實(shí)驗(yàn)配方配制成成品使用(配方:78%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油+4.5%蔗糖)。高脂飼料由湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)配方配制成成品使用(配方:82.5%普通飼料+2.5%膽固醇+8%蛋黃+7%豬油)。

1.3 材料及設(shè)備 甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、血糖(GLU)檢測試劑為瑞士Roche/Hitache公司原裝進(jìn)口試劑。STZ購于美國Sigma公司。GPS購自安康東科麥迪森天然藥業(yè)有限公司，純度為98%。全自動(dòng)生化檢測儀(瑞士產(chǎn)，Roche/Hitache7600)。冷凍低溫離心機(jī)(上海中科生物醫(yī)學(xué)高科技開發(fā)有限公司，DL-45R-L)。Olympus DP-70顯微攝影系統(tǒng)(日本，奧林巴斯公司)。德國產(chǎn)組織勻漿機(jī)。

1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組 SD大鼠購入后，普通飼料飼養(yǎng)觀察1 w，動(dòng)物無死亡及不良反應(yīng)。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將65只大鼠分為空白對(duì)照組(7只，N組)，NAFLD模型組(NM組，7只)，T2DM并NAFLD模型組(51只)。

1.4.2 T2DM并NAFLD造模與干預(yù) 參照文獻(xiàn)〔10〕，每鼠每天高糖高脂飼料20 g左右，分兩次投入，喂養(yǎng)4 w;大鼠隔夜空腹腹腔注射 STZ 40mg/kg，48h后尾靜脈取血，GLU＞11.1 mmol/L，納入實(shí)驗(yàn)組，造模成功率為100%;繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)至8 w，期間大鼠死亡15只。將全部大鼠分為GPS大劑量組(9只，JH組)，給予GPS 1 g·kg-1·d-1灌胃;GPS小劑量組(9只，JL組)，給予 GPS 0.5 g·kg-1·d-1灌胃;T2DM并NAFLD模型對(duì)照組(9只，M組)同等體積的純凈水灌胃;繼續(xù)給予高糖高脂飼料，自由飲水;治療周期為6 w;實(shí)驗(yàn)周期14 w。

1.4.3 N組、NM組飼養(yǎng)與管理 N組每天給予普通飼料20 g左右(根據(jù)NAFLD組進(jìn)食量調(diào)整);NM組給予高脂飼料20 g左右(依據(jù)前1 d進(jìn)食量決定第2天進(jìn)食量);飼料分2次投入。自由飲水。實(shí)驗(yàn)周期14 w。

1.5 標(biāo)本的采集與檢測

1.5.1 血液標(biāo)本的采集與處理 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露腹主動(dòng)脈，腹主動(dòng)脈采集血液10 ml于肝素管，離心取血清，保存于-20℃的冰柜中待檢。

1.5.2 血清TG、TC、BLU，肝組織TG檢測 同步按儀器和試劑說明書要求，檢測血清TG、TC、GLU，肝組織TG。

1.5.3 肝組織勻漿的制備 在肝臟最大葉邊緣0.5 cm處取小塊肝組織一塊，冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取0.5 g置于預(yù)冷的5 ml生理鹽水，迅速用內(nèi)切式勻漿機(jī)4 000 r/min勻漿10 s/次，間隙30 s，連續(xù)3次，碎冰塊中制成10% 的肝勻漿，高速冷凍離心機(jī)4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清3 ml密封，-20℃冷存待檢。

1.5.4 肝臟病理學(xué)檢測 在肝臟最大葉，取肝組織0.5 cm，常規(guī)固定、切片、HE染色，檢測肝臟病理學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)以s表示，治療前后組內(nèi)及組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)過程中大鼠數(shù)量變化 模型組在T2DM并NAFLD造模過程中，死亡大鼠15只，死亡率為29.41%;實(shí)驗(yàn)過程中，JH組、JL組、M組分別有1、2、3只大鼠死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)束JH組有8只，JL組有7只，M組有6只。NM組有6只。N組實(shí)驗(yàn)過程中無死亡。實(shí)驗(yàn)開始有65只，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)有41只。

2.2 GLU變化 見表1。NM組與JH組、JL組、M組差異顯著(P＜0.01);NM 組與 N 組存在顯著差異(P＜0.01)。

表1 模型組、干預(yù)組與對(duì)照組TG、TC、肝組織TG(s)

表1 模型組、干預(yù)組與對(duì)照組TG、TC、肝組織TG(s)

與 NM 組比較:1)P＜0.01;與 N 組比較:2)P＜0.01;與 M 組比較:3)P＜0.05

組別 n GLU(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)肝組織TG(mg/g)JH 組 8 13.12±1.081)2.64±0.482)3)6.88±1.112)3)142.87±6.642)JL 組 7 15.55±1.151)3.21±0.592)3)8.26±0.892)3)164.92±7.562)M 組 6 21.68±1.241)4.98±0.592)10.12±1.262)214.46±5.442)NM 組 6 7.92±0.72 3.56±0.412)7.98±1.022)198.46±6.982)N 組 7 4.98±0.441) 0.85±0.19 2.12±0.15 28.98±1.68

2.3 TG、TC變化 與N組比較，NM組、JH組、JL組、M組TG、TC 上升(P＜0.01)，JH 組、JL 組低于 M 組(P＜0.01)。見表1。

2.4 肝組織TG濃度 與N組比較，NM組、JH組、JL組、M組肝組織TG上升(P＜0.01)。見表1。

2.5 肝臟病理學(xué) N組為正常肝臟，NM組為重度FLD，MFLD程度最嚴(yán)重;JL與NM組程度相似;JH組FLD程度最輕。見圖1。

圖1 各組肝臟病理學(xué)改變(HE，×400)

3 討論

NAFLD與T2DM互為因果，已經(jīng)得到公認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)NAFLD模型對(duì)照大鼠存在GLU升高也說明這一點(diǎn)。T2DM與NAFLD在發(fā)病機(jī)制上存在“共同土壤”胰島素抵抗(IR)而成為其重要病因〔10〕。在糖尿病患者中，血漿游離脂肪酸(FFA)水平升高，TG增高，HDL水平降低，引起脂代謝紊亂，大量脂肪進(jìn)入肝細(xì)胞，在肝內(nèi)蓄積，形成脂肪沉著及肝細(xì)胞變性、腫大形成脂肪肝〔11〕。肝臟內(nèi)的脂肪沉積又導(dǎo)致 IR，形成惡性循環(huán)，加重糖、脂代謝紊亂，促進(jìn)FLD形成〔12〕。改善糖代謝紊亂、調(diào)節(jié)血脂代謝、減少TG在肝臟的沉積，對(duì)治療T2DM并NAFLD具有重要意義。

中醫(yī)認(rèn)為T2DM合并NAFLD是由于濕熱內(nèi)蘊(yùn)、痰瘀互結(jié);西醫(yī)“共同土壤學(xué)說”提出高血糖、血脂異常、胰島素抵抗、T2DM與慢性全身性低度炎癥狀態(tài)及氧化應(yīng)激有關(guān)。炎癥因子C反應(yīng)蛋白(CRP)在肝臟合成，F(xiàn)LD與CRP異常有關(guān)〔6〕?，F(xiàn)代藥理研究證明絞股藍(lán)含有83種與人參皂苷有類似骨架的達(dá)瑪烷型GPS，皂苷具有抗炎、降低血脂、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的生物活性和藥理作用〔13〕，Norberg等〔14〕從絞股藍(lán)中分離提純出一種新的皂苷，存在4種可以相互轉(zhuǎn)化的立體異構(gòu)體，在體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，其可刺激胰島細(xì)胞釋放胰島素，且呈現(xiàn)劑量依賴性。Xu等〔15〕對(duì)絞股藍(lán)中分離得到的皂苷及其衍生物的降糖作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其可以通過抑制蛋白酪氨酸磷脂酶來控制胰島素的敏感度，結(jié)合絞股藍(lán)對(duì)CRP升高有抑制作用、能降低兔肝臟脂質(zhì)沉積量，說明絞股藍(lán)及GPS具有多靶點(diǎn)干預(yù)T2DM并NAFLD作用。

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