朱錦燦 陳小宇 祝愛珍 劉成成 李 軍 劉革修 (暨南大學(xué)血液病研究所，廣東 廣州 510632)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在體內(nèi)的主要作用是通過形成新的組織間質(zhì)結(jié)構(gòu)，替代老化的間質(zhì)結(jié)構(gòu)，并能分化成多種新的組織細(xì)胞〔1〕。有研究報(bào)導(dǎo)小鼠MSCs能在小鼠體內(nèi)分化成肺上皮細(xì)胞〔2〕。這提示補(bǔ)充生長狀態(tài)良好的MSCs有利于其發(fā)揮修復(fù)損傷作用，通過輸注MSCs可能起到延緩老年人肺的肺臟退行性變的作用。本研究對(duì)老年小鼠輸注外源性MSCs，觀察其對(duì)老年小鼠肺功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕13.5 d BALB/c小鼠4只，12月齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠48只，體重(28±2)g，購于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(川)2004-15。將小鼠隨機(jī)分成移植組和對(duì)照組，每組24只。整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守中國科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒發(fā)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 材料 DMEM-F12液體培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)(Visual Sonics公司)，血乳酸(BLA)(南京建成生物工程研究所)，地塞米松、胰島素、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤、抗壞血酸、β-磷酸甘油、茜素紅(Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胎鼠MSCs的復(fù)蘇與培養(yǎng) 胎鼠MSCs的提取、培養(yǎng)與鑒定見文獻(xiàn)〔3〕，保存于本實(shí)驗(yàn)室液氮中。使用時(shí)從液氮中取出凍存管，于37℃水浴中不斷攪動(dòng)，使之迅速融化，吸出溶有細(xì)胞的凍存液加入事先準(zhǔn)備好的液體培養(yǎng)基中(37℃預(yù)熱，10倍體積)的離心管中，吹打，低速室溫離心(1 000 r/min，5 min)，上清液后重新制備細(xì)胞懸液，接種于含10%胎牛血清的DMEMF12完全培養(yǎng)基(含青、鏈霉素各100 U/ml)中，于37℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后全量換液，每3天換液1次。

1.3.2 移植胎鼠MSCs 取第3代胎鼠MSCs(約107個(gè)細(xì)胞)以尾靜脈注射的方式，對(duì)移植組每只小鼠進(jìn)行1次/月，連續(xù)注射3次胎鼠MSCs移植;同時(shí)在相同的條件下給予對(duì)照組小鼠注射等體積生理鹽水。

1.3.3 小鼠一般情況 對(duì)移植前后兩組小鼠進(jìn)行形態(tài)改變、精神狀況以及活動(dòng)度的觀察比較。

1.3.4 負(fù)重游泳試驗(yàn) 隨機(jī)選取兩組小鼠各8只，于移植胎鼠MSCs 3個(gè)月后進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，其中游泳箱水深40 cm，水溫(25±0.5)℃，水流速度8 L/min，小鼠尾根部捆綁鉛皮(質(zhì)量約為體重的5%)，記錄每只小鼠從放入水中至小鼠失去協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，10 s內(nèi)未能浮出水面的時(shí)間，并取出小鼠，毛巾拭干。

1.3.5 血清乳酸含量測定 隨機(jī)選擇對(duì)照組和移植組小鼠各8只，分別在上述游泳箱里游泳5min，分別于游泳前、游泳結(jié)束0、5 min 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)尾靜脈各取血20 μl，系統(tǒng)稀釋液稀釋后，血乳酸分析儀檢測各組小鼠血清中血乳酸的含量〔3〕。

1.3.6 超聲心動(dòng)圖情況 于胎鼠MSCs移植前以及移植3個(gè)月后，分別從對(duì)照組和移植組中隨機(jī)各選取8只小鼠，用Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)測量各組小鼠肺動(dòng)脈流速、心輸出量、左心室舒張末容積、每搏量。

1.3.7 組織學(xué)檢查結(jié)果 頸椎脫臼法處死全部小鼠，在肺相同部位取材，制作成石蠟切片后做肺組織學(xué)檢查，通過0～4分法雙盲打分法對(duì)小鼠肺臟組織衰老程度進(jìn)行評(píng)價(jià)〔4〕。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件分析，計(jì)量資料采用s表示，行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 移植后小鼠一般情況觀察 小鼠經(jīng)3次胎鼠MSCs輸注后未見輸注對(duì)其造成不良影響。與對(duì)照組相比，移植組小鼠的活動(dòng)量、精神狀態(tài)、毛發(fā)光澤度，食欲均有所改善。移植前以及移植3個(gè)月后兩組小鼠體重?zé)o顯著性差異。

2.2 MSCs對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響 移植MSCs 3個(gè)月后，與對(duì)照組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間(982±65)s相比，移植組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間(1 511±72)s有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 MSCs對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)前后血清乳酸的影響 經(jīng)5 min游泳試驗(yàn)后，對(duì)照組小鼠血清乳酸含量較運(yùn)動(dòng)前明顯增加，休息10 min后血乳酸水平有所下降，但仍高于運(yùn)動(dòng)前;移植組小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸含量也有升高，但較對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，休息10 min后移植組小鼠血乳酸值下降明顯，接近運(yùn)動(dòng)前的數(shù)值。見表1。

表1 移植MSCs對(duì)游泳實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠血清乳酸含量的影響(s，n=8，mmol/L)

表1 移植MSCs對(duì)游泳實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠血清乳酸含量的影響(s，n=8，mmol/L)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05

10 min對(duì)照組組別 游泳前 游泳結(jié)束0 min 游泳結(jié)束3.98 ±0.26 8.02 ±0.58 7.11 ±0.48移植組 3.75 ±0.31 7.23 ±0.391) 5.43 ±0.431)

2.4 超聲心動(dòng)圖情況 移植MSCs 3個(gè)月后，經(jīng)心臟超聲測量結(jié)果發(fā)現(xiàn);移植組肺動(dòng)脈平均血流速度較對(duì)照組(P＜0.05)。移植組中心臟輸出量、每搏輸出量、左室舒張期容積均較對(duì)照組小鼠高。見圖1。

2.5 組織學(xué)檢查結(jié)果 胎鼠MSCs移植3個(gè)月后，肺組織學(xué)檢查顯示，對(duì)照組肺臟的正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞，氣腔擴(kuò)大，呈肺氣腫改變等肺退行性變化征象。而移植組肺退行性變化征象明顯減輕。通過評(píng)價(jià)組織衰老程度的0～4分法雙盲打分顯示對(duì)照組衰老程度〔(1.35 ±1.16)〕較移植組〔(2.5 士1.15)〕輕(P ＜0.05)。見圖 2。

圖1 超聲心動(dòng)圖顯示兩組肺動(dòng)脈流速對(duì)比

圖2 兩組肺組織學(xué)對(duì)比(×100)

3 討論

12月齡BALB/c雌性小鼠(平均壽命多報(bào)道為561 d)肺臟會(huì)出現(xiàn)老年小鼠肺衰老的組織病理學(xué)變化:肺泡間隔明顯增寬，局部肺泡腔消失，實(shí)性變，肺間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生，肺泡上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，呈老年性肺氣腫征象。因此我們?cè)谶x取12月齡BALB/c雌性小鼠作為老年老鼠模型的基礎(chǔ)上，研究胎鼠MSCs能否改善老年小鼠的肺組織病理學(xué)及功能的退行性變化。首先我們成功提取胎鼠MSCs并通過流式細(xì)胞術(shù)、成脂油紅O染色及成骨茜素紅染色實(shí)驗(yàn)鑒定了我們的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為MSCs。接著對(duì)移植組小鼠輸注胎鼠MSCs 3個(gè)月后，通過與對(duì)照組做對(duì)比，發(fā)現(xiàn)小鼠做負(fù)重游泳試驗(yàn)及限時(shí)游泳后檢測血清乳酸含量發(fā)現(xiàn)移植胎鼠MSCs能有效提高運(yùn)動(dòng)耐力，從側(cè)面反映了移植胎鼠MSCs后，其心肺功能較對(duì)照組有所改善。超聲心動(dòng)圖檢查后發(fā)現(xiàn)移植MSCs后的小鼠左心功能各指標(biāo)(心輸出量、左心室舒張末容積、每搏量)均有明顯的改善，與已有研究報(bào)道一致〔5〕，肺動(dòng)脈流速也明顯下降。說明移植胎鼠MSCs后，小鼠的肺循環(huán)有明顯改善。同時(shí)組織切片顯示小鼠肺臟組織學(xué)衰退減輕。

以往研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將老年動(dòng)物的細(xì)胞置于年輕動(dòng)物的血液中，能起到使衰老的細(xì)胞變得年輕的作用〔6〕。在本實(shí)驗(yàn)中我們通過小鼠負(fù)重游泳及限時(shí)游泳后檢測血清乳酸含量游泳前后的變化間接說明移植MSCs后小鼠的心肺功能有所改善，運(yùn)動(dòng)耐力有所提高。因?yàn)樾姆喂δ艿脑鰪?qiáng)能為其運(yùn)動(dòng)時(shí)提供足夠的氧及能量，從而增加了有氧代謝，減少無氧酵解，達(dá)到減少了乳酸生成的作用。同時(shí)增強(qiáng)肝臟對(duì)乳酸的分解，提高機(jī)體耐力。同時(shí)，小鼠超聲心動(dòng)圖檢查直接證明小鼠的左心功能有所改善，與此同時(shí)，肺動(dòng)脈血流速度的減慢，說明了肺動(dòng)脈壓的下降，老年小鼠常見的老年性肺氣腫有所改善。聯(lián)合左心功能的改善及肺循環(huán)的改善，共同證明這胎鼠MSCs能改善老年心肺功能。對(duì)于胎鼠MSCs之所以能延緩老年小鼠肺的組織學(xué)衰老及改善肺功能衰退，可能通過以下機(jī)制:MSCs在肺內(nèi)的植入后通過分化為肺泡上皮細(xì)胞〔7～9〕(Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞〔7〕或Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞〔8〕)或分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞〔10〕，改善肺毛細(xì)血管網(wǎng)，從而改善肺組織的供血供氧和肺換氣功能?；蛘唠S著MSCs在肺內(nèi)的植入，分泌相關(guān)的多種細(xì)胞因子，最后達(dá)到修復(fù)肺組織的老化損傷，逆轉(zhuǎn)肺氣腫征象的作用。與此同時(shí)，向全身各組織器官輸送氧量增加，肺循環(huán)的改善對(duì)左心功能的改善起到積極作用。

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