岳曉烔

(貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)馬鈴鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025)

魚類血液生化指標(biāo)是反映魚體生理狀態(tài)的重要參數(shù)，也是診斷魚類疾病的重要指標(biāo);魚體一旦產(chǎn)生疾病，其血液生化指標(biāo)就會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變［1］。血液生化指標(biāo)常經(jīng)常被用來(lái)評(píng)價(jià)魚類的健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)狀況，是魚類極為重要的生理、病理和毒理學(xué)指標(biāo)［2］。此外，魚類的血清指標(biāo)在遺傳育種研究方面也具有重要的意義［3］。研究表明，魚類的血液指標(biāo)具有較大的變化范圍，受自身與外界因素的影響而波動(dòng)，主要與魚類的品種、年齡、養(yǎng)殖密度、水溫、鹽度、飼料成分以及攝食狀態(tài)等有關(guān)［4-7］。除此之外，血清樣品在離開動(dòng)物體后，仍在不斷地發(fā)生著各種反應(yīng)［8］，因而血清樣品在受檢前的保存時(shí)間、方式等可對(duì)其生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響?？梢?，樣品保存處理是檢驗(yàn)前質(zhì)量控制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在全程質(zhì)控中非常重要［9］。與其他材料的樣品檢測(cè)一樣，魚類血清檢測(cè)中也經(jīng)常會(huì)遇到許多意想不到的情況，例如儀器故障、試劑短缺、停水停電、遠(yuǎn)程檢驗(yàn)需要進(jìn)行樣品的郵寄以及待測(cè)樣本太多等，進(jìn)而使樣品采集后得不到及時(shí)檢測(cè)［9］。由此，待測(cè)血樣的保存方式及時(shí)間長(zhǎng)短將對(duì)其血清生化指標(biāo)的測(cè)定產(chǎn)生影響。目前，關(guān)于血樣保存條件對(duì)常規(guī)生化指標(biāo)影響的研究主要集中在人體臨床醫(yī)學(xué)中［9-12］，而有關(guān)動(dòng)物的相關(guān)研究則主要是針對(duì)哺乳動(dòng)物，如大白鼠等［13］。到目前為止，未見有關(guān)魚類血樣的保存方式及時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)其血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果影響的研究報(bào)道。本研究以瀕危野生魚類稀有白甲魚的血清樣品為材料，在-20℃貯存條件下，檢驗(yàn)血清樣品保存時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)其常規(guī)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果的影響，旨在為魚類血清的保存及其生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果的可靠性分析提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

稀有白甲魚實(shí)驗(yàn)魚于2012年6月采自貴州省境內(nèi)清水江(沅江水系)，共24尾。晚上乘漁船攔網(wǎng)采集實(shí)驗(yàn)魚個(gè)體，并將裝有實(shí)驗(yàn)魚的網(wǎng)兜置于河水暫養(yǎng)達(dá)12 h以上，期間網(wǎng)兜內(nèi)外水流相通，溶氧充足，魚體無(wú)食物來(lái)源，為避免因運(yùn)輸導(dǎo)致魚體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)人員于次日攜帶采血裝備于岸邊就地取血。實(shí)驗(yàn)魚體長(zhǎng)為191.04±42.02 mm，體重為207.64±148.25 g。

1.2 測(cè)定方法

采血時(shí)按邱郁春［14］的方法，自活體尾靜脈采血2～3 mL，注入5 mL EP離心管用冰袋保存，迅速移至室內(nèi)4℃冰箱中靜置10 min。待上清液析出時(shí)，在4 000 r/min條件下離心10 min，取上清液。將分別裝有24尾稀有白甲魚血清的EP離心管隨機(jī)分成兩組，每組12個(gè)血樣，全部密封放置于-20℃冰柜中冰凍保存。然后將兩組血清樣本分別于第10 d、第60 d按照所購(gòu)試劑盒附帶方法(表1)測(cè)定其15項(xiàng)生化指標(biāo)，包括總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血紅蛋白(Hb)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、肌酐(CREA)、總膽紅素(TBIL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)，記錄測(cè)定結(jié)果。每組樣本均于當(dāng)天測(cè)定完畢;試劑盒現(xiàn)用現(xiàn)購(gòu)，全部試劑盒均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所。

表1 稀有白甲魚血清生化指標(biāo)的測(cè)定方法Tab.1 Determination methods of biochemical parameters for serum samples from Onychostoma rara

1.2 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用EXCEL軟件和SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖類、脂類、蛋白質(zhì)及其代謝產(chǎn)物

由表2可知，在檢測(cè)的稀有白甲魚血清糖類、脂類、蛋白質(zhì)及其代謝產(chǎn)物共計(jì)10項(xiàng)生化指標(biāo)中，血紅蛋白(Hb)、總膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)和總膽紅素(TBIL)等4項(xiàng)生化指標(biāo)在血清樣本保存60 d時(shí)的測(cè)定值顯著低于保存10 d時(shí)的測(cè)定值(P＜0.05)。可見，該4項(xiàng)生化指標(biāo)在保存60 d時(shí)的測(cè)定值可信度差。在余下的6項(xiàng)生化指標(biāo)中，與保存10 d時(shí)的測(cè)定值相比，總蛋白(TP)和肌酐(CREA)在血清樣本保存60 d的測(cè)定值有所增加，而白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、尿酸(UA)在60 d時(shí)的測(cè)定值則出現(xiàn)了減少，但這6項(xiàng)生化指標(biāo)在前后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定值均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。因此，參照保存10 d時(shí)的測(cè)定值，該6項(xiàng)生化指標(biāo)在血清樣本保存60 d時(shí)的測(cè)定值依然具有較好的穩(wěn)定性和可信度。

2.2 血清酶活性

在測(cè)定的稀有白甲魚5項(xiàng)血清酶活性中，谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)與肌酸激酶(CK)在血清樣本保存60 d時(shí)的測(cè)定值顯著低于保存10 d時(shí)的測(cè)定值(P＜0.05)。而谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP)在血清樣品保存60 d時(shí)的酶活性與保存10 d時(shí)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，僅谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)的酶活性隨保存時(shí)間的增長(zhǎng)略有增加(P＞0.05)(表2)。由此，在這5種血清酶活性中，參照保存10 d時(shí)的測(cè)定值，在血清樣本保存 60 d時(shí)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP)的穩(wěn)定性較好、可信度較高，而谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)與肌酸激酶(CK)則顯著降低。

表2 不同保存時(shí)間的稀有白甲魚血清生化指標(biāo)測(cè)定(±s)Tab.2 Comparison of biochemical parameters of Onychostoma rara serum samples stored for different times

表2 不同保存時(shí)間的稀有白甲魚血清生化指標(biāo)測(cè)定(±s)Tab.2 Comparison of biochemical parameters of Onychostoma rara serum samples stored for different times

images/BZ_19_253_1109_1195_1242.png總蛋白g/L TP 101.30±6.80 104.34±8.21-0.988 0.334白蛋白g/L ALB 17.39±4.29 14.62±1.54 2.108 0.054血紅蛋白g/100mL Hb 14.92±3.29 11.25±1.90 3.344 0.003葡萄糖mmol/L GLU 7.35±0.35 7.21±0.40 0.884 0.386甘油三酯mmol/L TG 4.32±1.24 4.15±0.78 0.416 0.682總膽固醇mmol/L TC 5.65±1.77 4.18±1.26 2.341 0.029尿素氮mmol/L BUN 7.27±0.20 6.00±0.24 13.884 0.000尿酸mg/L UA 37.14±6.32 32.64±9.73 1.344 0.193肌酐umol/L CREA 15.02±3.68 16.01±2.58 -0.768 0.450總膽紅素μmol/L TBIL 79.04±44.57 40.28±25.64 2.612 0.018谷草轉(zhuǎn)氨酶U/L GOT 134.73±16.88 108.80±10.42 4.529 0.000谷丙轉(zhuǎn)氨酶U/L GPT 55.90±23.00 68.83±33.57-1.067 0.298乳酸脫氫酶U/mL LDH 22.83±4.42 21.30±3.23 0.965 0.345堿性磷酸酶U/L ALP 18.45±3.15 15.73±3.33 2.055 0.052肌酸激酶U/mL CK 29.03±2.05 24.25±4.96 3.086 0.008

3 討論

血液生化指標(biāo)是魚類的重要血液學(xué)特征。準(zhǔn)確測(cè)定魚類血液生化指標(biāo)是深入了解魚類血液學(xué)特征的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法的選擇得當(dāng)與否對(duì)魚類血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定有一定影響［15］，尤其是采集魚類血液的方法。對(duì)同一種魚采取不同采血方法測(cè)定結(jié)果有一定的差異，特別是當(dāng)對(duì)魚體的刺激過(guò)大時(shí)，其血液指標(biāo)尤其是生化指標(biāo)的影響較明顯［16］。華文青等曾用尾靜脈抽血和斷尾柄采血兩種方法采集羅非魚血樣進(jìn)行了對(duì)比研究，結(jié)果表明兩種方法所得血樣中的AST、ALT、AKP、CPK、N 及 P有明顯差異，而 GLU、TC、TP、Mg及氯化物沒有顯著差異［17］。這是由于斷尾柄采血對(duì)實(shí)驗(yàn)魚刺激較大可能引起了血液生化指標(biāo)較大的波動(dòng)。因此，在本研究中，采用的是對(duì)魚體刺激相對(duì)較小的尾靜脈抽血法來(lái)獲得魚血。然而，血液在離開魚體后仍然會(huì)發(fā)生著一系列的變化和反應(yīng)。因此，保存后的血液樣品，其質(zhì)量也會(huì)受很多因素的影響［18］。有關(guān)人體血液樣品保存對(duì)其生化檢驗(yàn)結(jié)果的影響國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道［19-20］。一般認(rèn)為，血液樣品冷藏可抑制細(xì)胞代謝、穩(wěn)定某些理化成分，但全血樣品一般不宜冷藏，因此臨床上一般均為冷藏其血清樣品［9］。按照我國(guó)有關(guān)部門規(guī)定，用于檢測(cè)的血清樣本在22～25℃保存不能超過(guò)8 h，8 h內(nèi)不能完成試驗(yàn)的應(yīng)置4～8℃保存，48 h內(nèi)不能完成試驗(yàn)的應(yīng)于-20℃保存［21］。由此，本實(shí)驗(yàn)中，先將稀有白甲魚全血冷凍離心后提取其血清進(jìn)行低溫(-20℃)保存，然后再用保存的血清進(jìn)行其血液生化指標(biāo)的測(cè)定。

本研究中，共計(jì)檢測(cè)了稀有白甲魚血清中15項(xiàng)生化指標(biāo)，其中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、尿酸(UA)、肌酐(CREA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP)等9項(xiàng)指標(biāo)在經(jīng)過(guò)不同保存時(shí)間后的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，表明該9項(xiàng)生化指標(biāo)在保存60 d時(shí)的測(cè)定結(jié)果是可信的，這為保存魚類血清樣品及合理安排試驗(yàn)時(shí)間提供了依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中最長(zhǎng)的保存時(shí)間為60 d，此時(shí)這9項(xiàng)生化指標(biāo)在低溫(-20℃)、密閉的保存條件下仍較穩(wěn)定，至于其在更長(zhǎng)保存時(shí)間后的穩(wěn)定性尚需進(jìn)一步探討。而血紅蛋白(Hb)、總膽固醇(TC)、尿素氮(BUN)、總膽紅素(TBIL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和肌酸激酶(CK)等6項(xiàng)生化指標(biāo)在不同保存時(shí)間后的檢查結(jié)果則顯示了明顯的差異，說(shuō)明這6項(xiàng)生化指標(biāo)在血清樣本較長(zhǎng)保存時(shí)間后的測(cè)定值穩(wěn)定性低、可信度差。然而，盡管不同血液生化指標(biāo)允許血清樣本保存的時(shí)間長(zhǎng)短不同，為了保證血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，血液樣本采集后應(yīng)盡快進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定［22-23］。

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