程吉東，溫淑云，楊大男

(德州市人民醫(yī)院，山東德州253014)

雷公藤作為一種植物藥，在臨床被廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕免疫性疾病，療效肯定，但同時存在明顯的毒副作用。臨床及實(shí)驗證實(shí)，雷公藤對生殖系統(tǒng)有較大影響，如導(dǎo)致女性月經(jīng)紊亂或閉經(jīng)、卵巢早衰，男性精子數(shù)量減少或無精子產(chǎn)生、不育，從而限制了其臨床應(yīng)用范圍［1］。2014年1～6月，我們觀察了乙葵沖劑對雷公藤致雌鼠生殖系統(tǒng)毒性的影響，旨在為臨床提供減毒用藥的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性SD小鼠40只，7～8周齡，由德州學(xué)院實(shí)驗動物房提供。雷公藤多苷片:國藥準(zhǔn)字Z33020422，由浙江得恩德制藥有限公司提供，10 mg/片。乙葵沖劑為自擬中藥方，由生地15 g、熟地15 g、肉蓯蓉30 g、山藥20 g、茯苓15 g、澤瀉15 g、菟絲子30 g、仙靈脾15 g、知母12 g、山萸肉9 g、丹參10 g、甘草6 g組成，藥物由單味中藥顆粒(廣州一方制藥有限公司生產(chǎn))配置成混懸液灌胃(相當(dāng)于成人量的15倍)。

1.2 實(shí)驗動物分組及處理 實(shí)驗前對每只雌性小鼠做陰道涂片10 d，選出連續(xù)2次為期4～5 d的正常性動周期小鼠30只，隨機(jī)分三組各10只，空白對照組不用任何藥物，雷公藤組給予雷公藤40 mg/(kg·d)，乙葵沖劑組給予雷公藤40 mg/(kg·d)加乙葵沖劑10 g/(kg·d)。三組均喂養(yǎng)90 d。實(shí)驗開始及結(jié)束10 d逐日做陰道涂片，以觀察脫落細(xì)胞，目的是選取正常性動周期動物(4～5次/d)、確定采血時間和觀察用藥后性動周期的變化。

1.3 血清孕酮(P)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)檢測 實(shí)驗前后各采血1次，時間在動情前期，由球后靜脈取血。采用ELISA法，試劑盒由上海江萊生物科技有限公司提供，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 陰道、子宮濕重計算及子宮、卵巢形態(tài)學(xué)觀察 對小鼠采取乙醚麻醉，剖腹，取卵巢、子宮、陰道，以10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色。取子宮及陰道，以分析天平稱重，計算各組織臟器系數(shù)(臟器重量g/100 g體質(zhì)量)。卵巢以4%多聚甲醛+0.5%戊二醛混合液中固定。材料修塊后經(jīng)1%鋨酸固定2 h，制半薄切片(1 μm)，用瑞士吉姆薩染色定位，修塊后做80～100 nm超薄切片，行醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。組織稱重法計算卵巢、子宮指數(shù)，病理切片觀察各時段卵巢、子宮組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組用藥前后血清 P、LH、E2、FSH水平比較結(jié)果見表1。

2.2 各組用藥前后陰道、子宮濕重比較 結(jié)果見表2。

表1 各組用藥前后血清P、LH、E2、FSH水平比較(±s)

表1 各組用藥前后血清P、LH、E2、FSH水平比較(±s)

注:與同組用藥前比較，﹟ P ＜0.05，*P ＜0.01;與雷公藤組比較，△P ＜0.05

組別 P(mIU/mL)LH(mIU/mL)E2(pmol/L)FSH(mIU/mL)6.39 ±1.33乙葵沖劑組用藥前 65.07 ±28.75 6.47 ±1.94 3.31 ±0.63 6.37 ±1.74用藥后 32.92 ±15.1＊△8.97 ±3.38﹟ 6.96 ±0.62＊△7.36 ±1.83雷公藤組用藥前 71.06 ±26.52 5.15 ±1.75 3.71 ±0.53 4.96 ±1.37用藥后 11.54 ± 3.25*7.26 ±2.83﹟ 1.21 ±0.33* 5.73 ±0.83空白對照組用藥前 57.86 ± 0.25 5.00 ±2.40 3.33 ±0.61 5.23 ±1.57用藥后 53.61 ± 0.57△ 6.11 ±3.10 3.37 ±0.65△

表2 各組用藥前后陰道、子宮濕重比較(g，±s)

表2 各組用藥前后陰道、子宮濕重比較(g，±s)

注:與同組用藥前比較，*P＜0.01;與空白對照組比較，△P＜0.01

組別 陰道濕重 子宮濕重0.011 ±0.002 0.020 ±0.003乙葵沖劑組用藥前 0.012 ±0.002 0.022 ±0.004用藥后 0.031 ±0.003＊△ 0.041 ±0.003＊△雷公藤組用藥前 0.013 ±0.001 0.025 ±0.002用藥后 0.002 ±0.001＊△ 0.011 ±0.005＊△空白對照組用藥前 0.012 ±0.001 0.021 ±0.005用藥后

2.3 各組小鼠子宮、卵巢形態(tài)學(xué)比較 結(jié)果見圖1～6?？瞻讓φ战M雌鼠子宮內(nèi)膜厚，腺體豐富，間質(zhì)細(xì)胞密度中等(圖1);卵巢體積大，卵泡生長活躍，可見各級卵泡，顆粒細(xì)胞層次多，卵泡液含量多，黃體發(fā)育好，體積大，黃體細(xì)胞豐富(圖4)。雷公藤組雌鼠子宮內(nèi)膜明顯變薄，腺體減少(圖2);卵巢體積萎縮，卵泡生長少，部分被纖維組織所代替，黃體數(shù)量少(圖5)。乙葵沖劑組雌鼠子宮內(nèi)膜厚，腺體豐富(圖3);卵巢體積大，卵泡生長多，顆粒細(xì)胞層次多，血供豐富，黃體細(xì)胞豐富(圖6)。

3 討論

雷公藤是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，歸肝、腎經(jīng)，味苦辛，性寒，有劇毒。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、祛風(fēng)除濕等功效，常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等自身免疫系統(tǒng)疾病，療效顯著。然而，雷公藤廣泛應(yīng)用臨床并發(fā)揮治療作用的同時，長期使用該藥有明顯的生殖毒性，會導(dǎo)致女性月經(jīng)減少、閉經(jīng)及男子精子減少、不育等，其生殖毒性日益受到關(guān)注［2］。

圖1 空白對照組子宮HE染色(20×10)

圖2 雷公藤組子宮HE染色(20×10)

圖3 乙葵沖劑組子宮HE染色(20×10)

圖4 空白對照組卵巢HE染色(10×6)

圖5 雷公藤組卵巢HE染色(10×6)

圖6 乙葵沖劑組卵巢HE染色(10×6)

目前，已有眾多學(xué)者對雷公藤生殖毒性進(jìn)行了大量的實(shí)驗研究，發(fā)現(xiàn)雷公藤制劑能降低子宮及卵巢臟器指數(shù)、可造成育齡期大鼠卵泡發(fā)育障礙和卵巢功能低下，損害卵巢功能及誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜凋亡基因的表達(dá)，使子宮管徑細(xì)，子宮內(nèi)膜上皮薄，腺體含量少，子宮肌層變薄，肌纖維排列較稀疏［3，4］。吳克明等［3］發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷可造成育齡期大鼠卵泡發(fā)育障礙和卵巢功能低下，表現(xiàn)為大鼠動情周期紊亂或消失，卵巢指數(shù)下降。于俊生等［4］給予大鼠雷公藤多苷灌胃，病理結(jié)果顯示其成熟卵泡數(shù)、黃體數(shù)減少，卵泡和黃體較小，子宮管徑細(xì)，子宮內(nèi)膜上皮薄，腺體含量少，子宮肌層變薄，肌纖維排列較稀疏。研究［3］報道，給予大鼠雷公藤多苷40 mg/kg灌胃后應(yīng)用放射免疫法檢測孕酮、雌二醇，結(jié)果顯示孕酮、雌二醇水平明顯下降。周昕欣等［5］認(rèn)為，雷公藤在病理、生理狀態(tài)下均能使孕酮降低，促濾泡素升高，促黃體生成素升高。王君等［6］給予小鼠灌服雷公藤多苷后取出卵母細(xì)胞，檢測卵母細(xì)胞的發(fā)育情況，并進(jìn)行體外受精，認(rèn)為其可明顯降低小鼠成熟卵母細(xì)胞的體外受精率，對卵母細(xì)胞的質(zhì)量和存活也有顯著的破壞作用，提示雷公藤多苷通過降低卵母細(xì)胞的受精能力和存活率而影響小鼠的生殖能力。研究［8］報道，雷公藤多苷使Bcl-2基因表達(dá)降低，Bax基因表達(dá)升高，說明雷公藤可以導(dǎo)致性腺抑制，誘導(dǎo)凋亡基因表達(dá)，最終使子宮內(nèi)膜細(xì)胞過度凋亡。

《黃帝內(nèi)經(jīng).素問.六節(jié)藏象論篇》曰:“腎者主蟄，封藏之本，精之處也”，可見五臟之中，腎與生殖功能關(guān)系最為密切，生殖功能受腎氣調(diào)控，生殖功能低下當(dāng)責(zé)之于腎虛，腎精、腎氣虧虛是生殖功能低下的根源。雷公藤之藥毒進(jìn)入人體后，一方面直接耗傷精血，使臟腑缺乏氣化的物質(zhì)基礎(chǔ)，而致臟腑功能失調(diào);另一方面通過損傷臟腑(主要為腎)，使氣血津液的生成、輸布、排泄障礙，導(dǎo)致濕、痰、瘀、毒留于體內(nèi)，使損傷更重。因此，雷公藤所致雌性小鼠生殖功能低下當(dāng)責(zé)之于其對腎精、腎氣的損傷，腎精腎氣虧損，則“腎主生殖”的功能減退。自擬方乙葵沖劑由六味地黃湯加味，六味地黃丸出自《小兒藥證直訣》，為宋代錢乙所創(chuàng)，是傳統(tǒng)中醫(yī)“滋陰補(bǔ)腎”的經(jīng)典名方，使用已近千載。其功效是滋陰補(bǔ)腎，兼益肝陰［8］。現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，乙葵沖劑能改善腎功能，促進(jìn)腎臟對體內(nèi)代謝產(chǎn)物尿素等的排泄［9］。方中生熟地、山藥、山萸肉、茯苓、澤瀉，滋腎陰、養(yǎng)精血;肉蓯蓉、菟絲子、仙靈脾溫補(bǔ)腎陽，肉蓯蓉“主五勞七傷，補(bǔ)中，除莖中寒熱，養(yǎng)五臟，強(qiáng)陰益精氣，多子”，既能溫通腎陽，又能滋養(yǎng)精血［10］?，F(xiàn)代研究［11］表明，肉蓯蓉具有雄性激素作用和促性腺激素樣作用，能發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)分泌腺軸的功能，促進(jìn)精子發(fā)生，使睪丸生精功能增強(qiáng);生地熟地并用取陰陽平衡之意，與知母、丹參同用使組方補(bǔ)而不熱，體現(xiàn)了“善補(bǔ)陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭”的觀點(diǎn)，全方的配伍注重寓調(diào)節(jié)腎的陰陽平衡于補(bǔ)腎之中，以平為期，補(bǔ)陰之中寓有補(bǔ)陽之用，共達(dá)補(bǔ)腎精、養(yǎng)精血、化瘀血之功。

本研究顯示，乙葵沖劑能增加應(yīng)用雷公藤小鼠陰道、子宮重量，光鏡下雌鼠子宮內(nèi)膜厚，腺體豐富卵巢體積大，卵泡生長多，顆粒細(xì)胞層次多，血供豐富，黃體細(xì)胞豐富;孕酮水平下降幅度明顯小于雷公藤組;促黃體生成素水平上升，與其他兩組比較無差異。說明乙葵沖劑可以拮抗雷公藤多苷對雌鼠生殖系統(tǒng)的毒副作用，對于雌鼠生殖系統(tǒng)具有保護(hù)作用，從而為臨床提供減毒用藥的理論依據(jù)，解決臨床上由于長期服用雷公藤多苷導(dǎo)致女性月經(jīng)紊亂、閉經(jīng)問題。

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