張 恒，潘 歆，陳志剛，吳廣勝

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832000)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)是臨床上常見的出血性疾病，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為，ITP是體液免疫和細(xì)胞免疫異常，導(dǎo)致血小板破壞增多、生成減少而最終以外周血血小板減少、皮膚黏膜出血為特征的疾病。血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa(CD41/CD61)復(fù)合物是血小板主要的膜糖蛋白，ITP患者體內(nèi)特異性的自身抗體主要針對該復(fù)合物［1，2］。CD62P是血小板 α 顆粒膜糖蛋白，又稱 P-選擇素，它在血小板活化時從α顆粒轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜上，是血小板活化的靈敏標(biāo)記物［3］。有文獻(xiàn)報道，ITP患者CD62P表達(dá)不同程度升高［4］。2012年1月～2013年8月，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)對ITP患者血小板表面CD41、CD62P的表達(dá)情況及T淋巴細(xì)胞亞群水平進(jìn)行檢測，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的血小板減少患者91例。其中，ITP患者54例(ITP組)，男19例，女35例;年齡15～84歲，中位年齡50歲;診斷均符合文獻(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)［5］。非免疫性血小板減少患者37例(非免疫血小板減少組)，男18例，女19例;年齡39～101歲，中位年齡62歲;其中急性白血病5例、巨幼細(xì)胞性貧血6例、再生障礙性貧血11例、骨髓增生異常綜合征13例、骨髓纖維化2例，均經(jīng)骨髓穿刺或病理明確診斷。正常對照26例(健康對照組)，男9例，女17例;年齡21～75歲，中位年齡53歲，均為體檢中心健康體檢者，均無特殊疾病史。

1.2 方法

1.2.1 外周血血小板CD41、CD62P檢測 采用FCM檢測。研究對象均清晨空腹，不扎止血帶，大號針管抽取靜脈血2 mL，EDTA抗凝，2 h內(nèi)進(jìn)行檢測。取混勻的全血5 μL加入FCM專用管中，實(shí)驗(yàn)管中分別加入5 μL的CD41-FITC和CD62P-PE單克隆抗體，對照管中加入5 μL同型對照熒光抗體。混勻后室溫(20～25℃)避光放置20～30 min，加入2 mL PBS混勻后上機(jī)檢測。通過Partec Flomax軟件處理分析，結(jié)果以CD41、CD62P陽性表達(dá)率表示。

1.2.2 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測 采用FCM檢測。取100 μL受試者新鮮抗凝全血于FCM專用管中，加10 μL抗人 CD-4FITC/CD-8PE/CD-3PE-CY5單克隆抗體，混勻后室溫避光放置20～30 min，固定、溶血后，F(xiàn)CM檢測。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用多個樣本比較的秩和檢驗(yàn)(Kruskal-Walis法)和多個樣本兩兩比較的秩和檢驗(yàn)(Nemenyi法)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血小板表面CD41、CD62P陽性表達(dá)率比較見表1。

表1 各組血小板表面CD41、CD62P陽性表達(dá)率比較(%，±s)

表1 各組血小板表面CD41、CD62P陽性表達(dá)率比較(%，±s)

注:與健康對照組比較，*P ＜0.05;與 ITP組比較，△P ＜0.05

組別 n CD+41 CD+62P ITP 組 54 45.60 ±19.99* 29.16 ±18.81*非免疫血小板減少組 37 65.93±21.89＊△ 26.62±14.97*健康對照組26 92.04 ± 4.35 4.02 ± 2.13

2.2 各組T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果 見表2。

3 討論

ITP是一種獲得性自身免疫性出血性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的1/3，國外流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，歐美國家成人ITP年發(fā)病率為5～10/10萬［1］，兒童ITP年發(fā)病率為 1.9～6.4/10 萬［6］。目前，ITP 的病因仍不清楚，認(rèn)為抗體介導(dǎo)的血小板清除、細(xì)胞免疫紊亂、T淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子平衡改變等多種因素參與ITP的發(fā)病［7］。臨床上 ITP的診斷缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”，需要排除自身免疫性疾病和其他原因所致繼發(fā)性血小板減少之后才能診斷ITP［8］，故有效的輔助檢查成為必要。本研究中，F(xiàn)CM檢測結(jié)果表明，ITP組血小板表面CD41陽性表達(dá)率明顯低于非免疫血小板減少組和健康對照組，與常麗賢等［9］結(jié)果一致。分析ITP患者血小板表面CD41陽性表達(dá)率減低的原因，主要有以下幾方面:①ITP患者體內(nèi)存在抗CD41的自身抗體，自身抗體與CD41的表位結(jié)合后，阻止CD41單抗與之結(jié)合。②ITP患者血小板活化后，CD41構(gòu)象發(fā)生改變，從而隱藏與CD41單抗結(jié)合的抗原表位。③ITP患者巨核細(xì)胞功能受抑、發(fā)育異常，導(dǎo)致其產(chǎn)生的血小板表達(dá)CD41減少。

表2 各組T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果(±s)

表2 各組T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果(±s)

注:與健康對照組比較，*P＜0.05

組別 n CD+3(%) CD+4(%) CD+8(%) CD+4/CD+8 ITP 組 54 63.32 ± 7.30* 32.73 ± 6.41* 26.71 ±5.61* 1.29 ±0.42*非免疫血小板減少組 37 64.02 ±14.90 33.57 ±11.65* 23.60 ±6.85 1.51 ±0.43*健康對照組 26 71.75 ± 9.42 41.68 ± 6.25 22.06 ±4.38 1.95 ±0.37

CD62P作為血小板活化的分子標(biāo)志物，在靜息血小板上表達(dá)很少。本研究結(jié)果顯示，ITP患者血小板表面CD62P陽性表達(dá)率比健康對照組高，提示在ITP患者血小板存在一定程度的活化。但本研究ITP組與非免疫血小板減少組CD62P陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示CD62P表達(dá)受多種因素影響。高血壓、糖尿病、多發(fā)性硬化等及危重患者［10～12］都可以出現(xiàn)CD62P的高表達(dá)，另外，標(biāo)本采集、處理等對血小板活化有一定的影響［13］，也會影響CD62P的表達(dá)，故不建議將CD62P作為診斷ITP的輔助檢測指標(biāo)。

T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果顯示，與健康對照組比較，ITP組CD+3、CD+4T淋巴細(xì)胞百分比及CD+4/CD+8均降低，CD+8T淋巴細(xì)胞百分比增高，提示細(xì)胞免疫參與ITP發(fā)病，T淋巴細(xì)胞比例失調(diào)、免疫耐受丟失，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞增殖并激活，產(chǎn)生抗血小板抗體，而破壞血小板可能是其發(fā)病機(jī)制之一［14］。因而，檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平有助于ITP的診斷及鑒別［15］。

總之，ITP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床診斷缺乏既敏感又特異的方法，仍為排除性診斷。應(yīng)用FCM檢測外周血血小板CD41及T淋巴細(xì)胞亞群水平對ITP診斷具有一定的臨床價值，而更為有效的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有待建立。

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