閆美鳳，張永勝

0 引 言

胃癌是世界范圍內(nèi)占惡性腫瘤發(fā)病率第4位(約占全球惡性腫瘤發(fā)病的7.8%)，死亡率占第2位(約占全球惡性腫瘤死亡的9.7%)的一種惡性腫瘤疾病［1-2］。而胃癌在我國的發(fā)病率及死亡率均居于首位。有資料顯示，我國每年大約新增胃癌患者40萬，其中近3/4的患者死亡［3］。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的復(fù)雜過程［4］。人類p53基因定位于17號染色體(17q13.1)，編碼由393個氨基酸組成的相對分子質(zhì)量為53000的蛋白質(zhì)。p53蛋白與DNA密切結(jié)合，具有轉(zhuǎn)錄監(jiān)管的功能，還可以作為抑癌基因抑制異常細胞的增殖以及保持基因組的完整性。若p53基因在內(nèi)在或外在因素的刺激下發(fā)生改變，則會導(dǎo)致p53蛋白失去對細胞的轉(zhuǎn)錄控制的部分功能，使細胞因遺傳不穩(wěn)定而發(fā)生惡變，形成腫瘤［5-6］。Gadd45a是生長抑制 DNA損傷基因(growth arrest and DNA-damage-inducible protein 45，Gadd45)家族中的一員。該家族的功能涉及對細胞凋亡、生存、衰老進程的調(diào)節(jié)，細胞周期的調(diào)控及DNA損傷的修復(fù)。Gadd45a是第1個被檢出的p53下游靶基因。在Gadd45a基因中，p53調(diào)節(jié)區(qū)定位于該基因的第3內(nèi)含子。受p53基因上調(diào)，該基因控制細胞周期的G2/M期，從而控制細胞增殖/凋亡的平衡［7］。董明等［8］和高其忠［9］研究表明，p53 和Gadd45a蛋白在胰腺癌、乳腺癌組織中均有較高表達。目前關(guān)于p53與Gadd45a在惡性腫瘤組織中表達的研究主要集中于基因測序方法，存在測序程序復(fù)雜、費用高，且p53與Gadd45a基因突變位點多等問題。先前研究表明，運用免疫組織化學(xué)方法檢測靶蛋白的表達可以反映90%以上的對應(yīng)靶基因狀態(tài)［10］。本研究將采用免疫組織化學(xué)方法檢測胃癌組織及癌旁組織中p53與Gadd45a蛋白的表達情況，探討其可能的臨床病理意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年5月至2012年7月間內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院及內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院普外科收治，具有完整臨床資料記錄，且術(shù)前未經(jīng)放療、化療，全部病灶行手術(shù)切除的101例胃癌患者手術(shù)切除的癌及癌旁組織標(biāo)本。所有標(biāo)本都經(jīng)病理科醫(yī)師確診病變程度。每例標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。101例患者中，男性81例、女性20例，年齡21～81歲，平均(53.6±11.2)歲。分化程度:高分化腺癌14例、中分化腺癌52例、低分化腺癌35例。根據(jù)第6版(2002年)國際抗癌協(xié)會(Union for International Cancer Control，UICC)的UICC/TNM分期標(biāo)準分為Ⅰ期5例、Ⅱ期12例、Ⅲ期75例、Ⅳ期9例。

1.2 實驗用試劑 Gadd45a兔抗人單克隆抗體(貨號H00001647-MO1);p53鼠抗人單克隆抗體(貨號MAB-0142);免疫組織化學(xué)SP染色試劑盒(貨號KIT-9710)購自福建邁新生物工程有限公司。

1.3 實驗方法 采用SP免疫組織化學(xué)方法檢測。石蠟包埋組織切片(4 μm)經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，按試劑盒操作說明進行，微波抗原修復(fù)，Gadd45a抗體和p53抗體(2種抗體均為1∶100稀釋)，PBS代替第一抗體作陰性對照，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示。p53和 Gadd45a表達的相關(guān)性分析采用Spearman檢驗;組間比較采用t檢驗，以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 p53和Gadd45a蛋白在胃癌及癌旁組織的表達 p53以核表達為主，Gadd45a為細胞質(zhì)表達，陽性染色呈棕黃色或棕褐色顆粒物表達。每張染色的切片隨機選取5個視野，利用捷達801生物顯微圖象分析系統(tǒng)對Gadd45a、p53蛋白表達進行分析，以蛋白的陽性表達率來判定結(jié)果。即＞20%的腫瘤細胞核內(nèi)棕褐色顆粒著色者為p53蛋白陽性表達;＞50%的腫瘤細胞細胞質(zhì)內(nèi)棕褐色顆粒著色者為Gadd45a蛋白表達陽性。見圖1。

2.2 p53和Gadd45a蛋白在胃癌及癌旁組織的表達及相關(guān)性 p53蛋白在癌組織中的表達較癌旁組織高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而Gadd45a蛋白的表達情況與其相反。兩者在癌組織中的表達與組織的高、低分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。p53和Gadd45a蛋白的表達經(jīng)Spearman等級相關(guān)性檢驗提示，兩者之間無相關(guān)性(rs=-1.54，P ＞0.05)。見表1。

2.3 p53和Gadd45a陽性表達與性別、年齡關(guān)系 101例患者中，胃癌及癌旁組織中，p53蛋白表達的陽性率分別為67.33%、12.97%。Gadd45a蛋白表達的陽性率分別為33.79%、79.18%，兩者在癌組織與癌旁組織的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。不同性別、年齡間患者p53與Gadd45a陽性表達率在癌組織與癌旁組織間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

圖1 p53和Gadd45a蛋白在胃癌及癌旁組織表達的免疫組化結(jié)果(SP×100)Figure 1 The results of the expression of p53 and Gadd45a protein in gastric cancer and cancer adjacent tissues by immunohistochemical technique(SP×100)

表1 p53和Gadd45a蛋白的表達與胃癌患者的臨床病理參數(shù)(%)Table 1 The relationship between the expression of p53 and Gadd45a protein and clinical pathological parameters in patients with gastric cancer(%)

表2 p53和Gadd45a陽性表達與性別、年齡關(guān)系(%)Table 2 The relationship between the positive expression of Gadd45a and p53 protein and gastric cancer patients'gender，age(%)

3 討 論

p53蛋白的異常表達與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，檢測p53蛋白水平對胃癌的診斷有一定價值［11］。p53基因分為野生型和突變型2種，其產(chǎn)物也有野生型與突變型。突變型p53促進細胞增殖與凋亡。野生型p53蛋白的半衰期短，免疫組化染色不能檢出，免疫組化染色者均為突變后喪失原有功能的p53蛋白。本實驗結(jié)果表明，p53蛋白隨著胃癌組織由高到低的分化程度、TNM分期(Ⅰ-Ⅳ)表達逐漸增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。按淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移將胃癌分為2組，p53蛋白表達在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與文獻報道的p53蛋白的過度表達在胃癌黏膜細胞癌變過程中其重要作用，并與胃癌進展相關(guān)的結(jié)論相一致［12］。

近年來的研究顯示，Gadd45a是DNA損傷后誘導(dǎo)表達的基因之一，也是抑癌基因p53和BRCA1的下游靶基因。其基因序列具有很高的同源性，通常在環(huán)境損傷因子(如紫外線放射、低氧、基因毒性藥物等)作用后隨著DNA修復(fù)途徑的啟動而誘導(dǎo)產(chǎn)生［13］。細胞DNA損傷誘導(dǎo)Gadd45a表達使細胞發(fā)生G2/M期阻滯，調(diào)節(jié)細胞凋亡和存活等多條信號傳導(dǎo)通路、在決定細胞命運中有著重要的作用［14］。本研究中應(yīng)用免疫組化的方法檢測了101例胃癌患者腫瘤組織和癌旁組織中Gadd45a的表達情況，結(jié)果顯示其在癌旁正常組織中的表達明顯高于腫瘤組織，并且隨著腫瘤組織分化程度(由高到低)、TNM分期的增高表達有下降的趨勢。結(jié)果與文獻報道相一致［15］。此外，本研究還開展對p53與Gadd45a兩者蛋白表達的Spearman等級相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩者之間無相關(guān)。究其原因可能為:①胃癌的發(fā)生是多種癌相關(guān)基因協(xié)同作用的結(jié)果。不同基因間信號調(diào)節(jié)具有復(fù)雜性。本組所研究的癌相關(guān)基因Gadd45a既可以通過依賴于p53基因路徑，也可以通過獨立于p53基因路徑參與影響細胞凋亡過程。②單純依靠免疫組織化學(xué)方法檢測p53與Gadd45a蛋白在腫瘤組織中的表達，不能完全準確地反映對應(yīng)靶基因狀況;③可能與本組研究的病例數(shù)有限有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明胃癌組織中Gadd45a與p53基因在分化程度、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期較晚的胃癌組織中表達發(fā)生變化，而與年齡、性別無關(guān)，說明Gadd45a與p53基因胃癌組織的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要的作用并與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Gadd45a在體內(nèi)發(fā)揮的作用機制復(fù)雜，在不同的條件下機制和功能都相應(yīng)轉(zhuǎn)化。隨著腫瘤研究的深入，Gadd45a在決定細胞存活或是凋亡中發(fā)揮的作用會越來越明確，這將進一步為在生物領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。聯(lián)合檢測胃癌組織標(biāo)本中Gadd45a與p53的表達在臨床診斷治療方面有進一步研究價值。

［1］ 季玉連，趙樹立，趙光峰，等.pokemon通過抑制p53和上調(diào)白細胞介素6抑制胃腫瘤細胞BGC823凋亡［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012，25(11):1155-1159.

［2］ Shokal U，Sharma PC.Implication of microsatellite instability in human gastric cancers［J］.Indian J Med Res，2012，135(5):599-613.

［3］ Kato M，Asaka M.Recent development of gastric cancer prevention［J］.Jpn J Clin Oncol，2012，42(11):987-994.

［4］ Matsunaga M，Onishi H，Ishida M，et al.Hypomanic episode during recurrent gastric cancer treatment:report of a rare case and literature review［J］.Jpn J Clin Oncol.2012，42(10):961-964.

［5］ Najjar Sadeghi R，Damavand B，Vahedi M，et al.Detection of p53 common intron polymorphisms in patients with gastritis lesions from Iran［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14(1):91-96.

［6］ Liu X，Wang S，Xia X，et al.Synergistic role between p53 and JWA:prognostic and predictive biomarkers in gastric cancer［J］.PLoS One，2012，7(12):e52348.

［7］ Johnen H，González-Silva L，Carramolino L，et al.Gadd45g is essential for primary sex determination，male fertility and testis development［J］.PLoS One，2013，8(3):e58751.

［8］ 董 明，周建平，孔凡民，等.p53和Gadd45a蛋白在胰腺癌組織中的表達及臨床病理學(xué)意義［J］.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2005，27(5):628-632.

［9］ 高其忠.細胞周期調(diào)節(jié)因子p21WAF1、p53及Gadd45a在乳腺癌組織中的表達及意義［D］.蘇州大學(xué)，2011.

［10］ Melhem MF，Law JC，el-Ashmawy L，et al.Assessment of sensitivity and specificity of immunohistochemical staining of p53 in lung and head and neck cancers［J］.Am J Pathol，1995，146(6):1170-1177.

［11］ 何均輝，鄒秀玲，李忠楚，等.P53蛋白在胃癌中的表達分析［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，9(5):86，88.

［12］ 肖 鳳，王伴青，溫永順，等.胃癌及其癌前病變組織中p16及p53蛋白的表達［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，26(3):286-287.

［13］ 劉冬梅，王 剛，李國文，等.6MVX射線對人食管癌EC9706細胞Gadd45α基因表達的影響［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志，2011，31(2):198-199.

［14］ 馮雪鳳，王迎偉.DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因Gadd45的研究進展［J］.癌變·畸變·突變，2009，21(5):404-407.

［15］ 朱亞杰，邱 萌，周繼陶，等.胃癌中P53蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的分析及其臨床意義［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2010，27(1):60-65.