黃 艷，劉 鑫，廖端芳

(1.南華大學(xué)，湖南衡陽 421001;2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，湖南衡陽 421001;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410208)

肺癌是嚴重危害人類健康的疾病之一，無論是發(fā)病率還是死亡率均居全球癌癥首位，其中75% 為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。由于缺乏早期的診斷方法，大多數(shù)患者在診斷時已是局部晚期，即使完全切除仍有相當部分出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［1］。單純手術(shù)治療的5年生存率為20% ～25%［2］，單純根治性手術(shù)獲益亦有限［3］，即使有手術(shù)切除機會也有部分患者拒絕手術(shù)。放射療法是晚期患者的主要治療方法，但常規(guī)放療療效差，且其不良反應(yīng)大，5年生存率僅為10%左右［4］。以內(nèi)皮抑制素為主的新型聯(lián)合放化療雖能抑制腫瘤血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移，使腫瘤細胞凋亡且不產(chǎn)生耐藥，但也有毒副作用［5］。近年來，中藥在治療非小細胞肺癌方面以其可靠的療效顯示出良好的趨勢，柴胡龍牡湯在臨床上治療非小細胞肺癌有肯定的療效［6］。本實驗對柴胡龍牡湯治療Lewis肺癌的作用和毒副反應(yīng)進行了研究和觀察。

1 材料與方法

1.1 藥物

柴胡龍牡湯組成:柴胡12 g，黃芩15 g，法半夏15 g，黨參10 g，茯苓20 g，合歡皮20 g，鉤藤12 g，炒酸棗仁30 g，郁金15 g，生龍骨30 g，生牡蠣30 g，石菖蒲12 g，炙甘草8 g。藥物煎煮2次，分別加10倍或8倍的水煎煮60 min或40 min，合并煎液過濾后濃縮至生藥1.0 g/mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

1.2 動物

C57BL/6J近交系小鼠40只，鼠齡6周，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級雌雄各20只，購于北京維通利華實驗動物有限公司(許可證號 SCXK(京)2006-0009，質(zhì)量合格證編號0230988)。

1.3 試劑

Lewis肺癌細胞株(Lewis lung cancer cells)由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細胞中心免疫實驗室提供。MTT法試劑盒、ELISA法IFN-α試劑盒和ELISA法IL-10試劑盒由上海生物工程有限公司提供。

1.4 儀器

CHD型光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus)，SpectraMax M5型酶標儀(美國 Molecular Devic)，Biofuge Stratos型低溫高速離心機(德國heraeus公司)、產(chǎn)品圖像采集及圖像分析系統(tǒng)(美國BioRad)。

1.5 實驗方法

實驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在每只小鼠皮下注射培養(yǎng)Lewis肺癌細胞株0.2 mL，5 d后將造模成功的40只小鼠按隨機數(shù)字表法分成柴胡龍牡組、模型組、順鉑放射組和恩度聯(lián)合NP組4組。柴胡龍牡組小鼠給予柴胡龍牡湯400 mg/d(0.4 mL/d，含生藥 0.4 g)［8］，模型組小鼠給予生理鹽水 0.4 mL/d灌胃，順鉑化療組實施順鉑治療每天1 mg/kg，以上各組每天治療1次，持續(xù)2周。恩度聯(lián)合NP組于第1、8天長春瑞賓(NVB)25 mg/m2靜脈推注，第1天順鉑(CDDP)80 mg/m2靜脈推注，每天給予恩度15 mg靜脈滴注。靜脈滴注治療結(jié)束后處死動物，取出肺臟的腫瘤組織，去除小鼠的肺組織進行稱重，固定于4%的多聚甲醛中，觀察計數(shù)每只小鼠肺組織轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的個數(shù);取處于對數(shù)增殖期的Lewis肺癌細胞給予1∶100稀釋的柴胡龍牡湯藥湯，模型組、順鉑放射組、恩度聯(lián)合NP組給予同樣稀釋度的生理鹽水，分別于加藥后0 d、1 d、2 d、3 d測量進行測量，測量之前，在每孔加 MTT50 μL(5 mg/mL)，于37℃、95%O2、5%CO2的培養(yǎng)箱孵育 4 h，加 150 μL DMSO，室溫振蕩10 min，酶標儀檢測OD570的吸光度值;在小鼠脾淋巴細胞懸液中加入100 μL1640培養(yǎng)液(含ConA)，在50 mL/L二氧化碳濃度、37℃的培養(yǎng)箱條件下進行36 h的培養(yǎng)，取上清液用ELISA法測定IFN-γ和IL-10含量。

2 結(jié)果

2.1 給藥前后小鼠質(zhì)量的變化

表1顯示，造模成功后給藥2周，模型組質(zhì)量沒有明顯變化，柴胡龍牡湯組質(zhì)量較之前明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;順鉑化療對照組和恩度聯(lián)合NP對照組實驗動物質(zhì)量明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 給藥前后小鼠質(zhì)量變化(±s)

表1 給藥前后小鼠質(zhì)量變化(±s)

注:與模型組比較:P＜0.05，柴胡龍牡湯組質(zhì)量明顯增加

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)給藥前質(zhì)量(g)給藥后質(zhì)量(g)R順鉑化療對照組400 10 20.01 ±0.21 22.32 ±1.97 1.115 0.02 10 20.00 ±0.22 15.33 ±0.45 4.671恩 度 聯(lián) 合 NP 對 照 組 15.00 10 19.54 ±0.25 16.01 ±0.33 3.820模 型 組 400 10 9.32 ±0.24 20.19 ±2.13 1.045柴胡龍牡湯組

2.2 4組實驗動物腫瘤的質(zhì)量變化

表2顯示，以模型組為對照，柴胡龍牡湯組、順鉑化療組、恩度聯(lián)合NP組動物的腫瘤質(zhì)量均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明柴胡龍牡湯、順鉑化學(xué)治療和恩度聯(lián)合NP治療均能抑制腫瘤組織的增殖。柴胡龍牡湯組的抑瘤率(36.9%)＜順鉑化療組(45.7%)＜恩度聯(lián)合NP治療組(46.3%)，說明柴胡龍牡湯的抑制腫瘤功效小于順鉑治療法和恩度聯(lián)合NP治療法。抑瘤率=(1－柴胡龍牡湯組腫瘤質(zhì)量/模型對照組腫瘤質(zhì)量)×100%。

2.3 3組實驗動物腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)比較

表3顯示，以模型組為對照，柴胡龍牡湯組、順鉑放射組和恩度聯(lián)合NP治療組動物的腫瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明柴胡龍牡湯和順鉑化學(xué)治療均能抑制腫瘤肺組織的轉(zhuǎn)移。柴胡龍牡組的轉(zhuǎn)移抑制率(29.3%)＜順鉑放射組(44.6%)＜恩度聯(lián)合NP治療組(46.3%)，說明柴胡龍牡湯抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移的功效小于順鉑化學(xué)療法和恩度聯(lián)合NP治療法。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制率=(1－柴胡龍牡湯組平均每只小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個數(shù)/對照組每只小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個數(shù))×100%。

表2 4組實驗小鼠瘤重和抑瘤率(±s)

表2 4組實驗小鼠瘤重和抑瘤率(±s)

注:與模型組比較:T=3.789，P=0.001，柴胡龍牡湯組肺腫瘤質(zhì)量明顯減少

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)出瘤情況(n)瘤重(g)抑瘤率(%)順 鉑 放 射 對 照 組0.02 10 9 1.61 ± 0.71 45.7恩 度 聯(lián) 合 NP 對 照 組 15 10 10 1.57± 0.37 46.3模型組 400 10 10 2.88± 0.50 —400 10 10 1.82 ± 0.91 36.9柴胡龍牡湯組

2.4 柴胡龍牡湯和模型組細胞增殖能力比較

表4顯示，柴胡龍牡湯組肺癌細胞的數(shù)量在第2天和第3天明顯少于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

表3 柴胡龍牡湯對小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響(±s)

表3 柴胡龍牡湯對小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響(±s)

注:與模型組比較:T=2.268，P=0.032，柴胡龍牡湯組肺腫瘤轉(zhuǎn)移灶/只明顯減少

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的樣本(n)轉(zhuǎn)移灶(個/只)轉(zhuǎn)移抑制率(%)順鉑化療對照組400 10 10 1.62 ±1.21 29.3 0.02 10 8 0.78 ±2.24 44.6恩 度 聯(lián) 合 NP 對 照 組 15 10 7 0.72 ±2.12 48.2模 型 組 400 10 10 3.98 ±3.56 —柴胡龍牡湯組

表4 MTT檢測2組處理對于細胞增殖能力的影響OD570，±s

表4 MTT檢測2組處理對于細胞增殖能力的影響OD570，±s

注:*P＜0.05，表示加藥處理后第2天和第3天柴胡龍牡湯組肺癌細胞數(shù)明顯少于模型組

組別 劑量(mg/d)0 d 1 d 2 d 3 d模型組0.89 0.011 0.02 400 0.23 ±0.32 0.30 ±0.13 0.74 ±0.10 0.85 ±0.12柴胡龍牡湯組 400 0.23 ±0.33 0.28 ±0.22 0.32 ±0.13* 0.34 ±0.23*t—0.135 4.435 3.405 P—

2.5 3組實驗動物血小板、紅細胞、白細胞、中性粒細胞、血紅蛋白比較

表5顯示，柴胡龍牡湯組的血小板紅細胞、白細胞、血紅蛋白和模型組、順鉑化療組、恩度聯(lián)合NP治療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，4組實驗動物中性細胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表5 4組實驗動物治療前后的血小板、紅細胞、白細胞、中性粒細胞、血紅蛋白比較(±s)

表5 4組實驗動物治療前后的血小板、紅細胞、白細胞、中性粒細胞、血紅蛋白比較(±s)

注:*P＜0.05，表示柴胡龍牡湯治療后血小板紅細胞、白細胞、血紅蛋白與模型組、順鉑化療組、恩度聯(lián)合NP治療組比較，柴胡龍牡湯組對上述指標無明顯影響

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)時 間 WBC(×109/L)中性粒細胞(×109/L)Pt(×109/L)RBC(×1012/L)HGB(g/L)順 鉑 化 療 對 照 組 0.02 10 治療前 7.63 ±1.41 5.46 ±1.59 133.46 ±23.68 3.61 ±0.34116.31 ± 8.48治療后 15.11 ±2.65 8.31 ± 5.29 60.82 ± 17.71 6.41 ±3.24 162.23 ±11.9恩度聯(lián)合NP對照組 15 10 治療前 7.98±1.23 5.68 ±1.48 137.23±21.65 3.67±0.58 116.22± 5.43治療后 14.22 ±2.11 8.23 ±4.08 80.47 ±18.10 5.43 ±2.27 155.21 ± 9.79模 型 組 400.00 10 治療前 8.32 ±1.71 5.64 ±1.76 134.35 ±18.33 3.71 ±0.85 116.17 ± 6.64治療后 — — — —柴 胡 龍 牡 湯 組 400.00 10 治療前 8.02 ±1.57 5.72 ±1.74 139.15 ±16.50 3.58 ±1.05 116.25 ± 4.78治療后 4.29 ±1.69 3.15 ±1.23 100.38 ±16.94 4.01 ±0.87 115.57 ± 3.56*

2.6 各組小鼠脾上清液中自然殺傷細胞活性、脾上清液中IFN-γ和IL-10含量比較

表6顯示，柴胡龍牡湯組小鼠脾上清液中自然殺傷細胞活性明顯高于模型組和順鉑化療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);柴胡龍牡湯組高于順鉑化療組和恩度聯(lián)合NP治療組的脾上清液中IFN-γ含量，模型組明顯更少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);柴胡龍牡湯組小鼠脾上清液IL-10含量明顯低于模型組、順鉑化療組和恩度聯(lián)合NP治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.7 各組小鼠的脾臟T淋巴細胞亞群的比較

表7顯示，柴胡龍牡湯組脾臟T淋巴細胞的CD4+、CD4+/CD8+比值和模型組、順鉑放射組、恩度聯(lián)合NP治療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，CD8+差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

3 討論

原發(fā)性支氣管肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居各種惡性腫瘤之首，由于腫瘤的隱匿性和早期診斷方法的缺乏，導(dǎo)致大約2/3的患者在確診時已屬晚期［7］。目前晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的治療 NCCN指南推薦以放化療聯(lián)合為主的模式，其中一線標準治療以4～6個周期含鉑雙聯(lián)方案化療為主 ，有效率僅20% ～40%，中位生存期8～10個月［9］，雖然可短時期內(nèi)控制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，改善患者癥狀，但大部分患者在3～4個月后出現(xiàn)病情的進展與惡化。絕大多數(shù)抗腫瘤藥物缺乏理想的選擇性和靶細胞作用，因此在抑制腫瘤的同時，往往不同程度地影響機體正常組織細胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及重要臟器，影響患者生存質(zhì)量，使許多患者難以接受和堅持化療?；熓遣荒苁中g(shù)患者和手術(shù)未能根治的患者的主要治療方法［4］，單純化療療效不令人滿意，2年以上生存率僅為10% ～20%［10］。以上治療方法失敗的原因在與局部治療的失控和(或)腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移［11］。中醫(yī)藥在治療晚期肺癌中發(fā)揮了獨特的優(yōu)勢，它能延長患者生存期，改善生存狀況且能增效解毒。目前已有很多種中藥制劑應(yīng)用于臨床，如消積飲、長必安膠囊、十全大補湯、健脾益肺化瘀方、益肺抗瘤飲、槲皮素等。實驗證實，它們都對小鼠的Lewis肺癌具有明顯的抑制作用，其主要機理為抑制腫瘤細胞周期的DNA合成，影響Lewis肺癌細胞的基因表達，從而達到抑制肺癌細胞的分裂與增殖，糾正免疫微循環(huán)紊亂;影響腫瘤細胞凋亡而起到抑制腫瘤作用;抑制Lewis肺癌毛細血管生成，降低血管內(nèi)皮細胞生長因子的表達，促使樹突浸潤成熟，微血管減少可導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)缺血缺氧引起腫瘤細胞凋亡，由此減少由血行擴散而導(dǎo)致的腫瘤轉(zhuǎn)移等［12］。目前中醫(yī)認為，腫瘤的發(fā)生與氣機升降失常有密切關(guān)系，可通過調(diào)理肝、脾、腎來減輕惡性腫瘤患者的臨床癥狀，提高生質(zhì)量。《素問·至真要大論》指出，疾病的治療原則是“高者抑之，下者舉之”、“疏其氣血，令其條達，而致和平”，也就是調(diào)和陰陽、平衡氣血。柴胡龍牡湯由小柴胡加龍骨牡蠣湯加減而成，具有理肝、化飲、調(diào)陰陽、和榮衛(wèi)、助升降、和肝膽、鎮(zhèn)驚止悸作用，臨床多用于抑郁癥的治療，被認為是治療郁癥、驚悸怔忡、失眠、癲狂等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主方之一。由于柴胡龍牡湯的調(diào)暢氣機作用，則陰陽氣血調(diào)和，以達“陰陽和則疾病自愈”的特殊作用，與腫瘤的部分機制相類似，因此有作者以此方治療肺癌患者取得了較好的療效［13］。

表6 各組小鼠自然殺傷細胞活性、脾上清液中IFN-γ含量、脾上清液中IL-10含量比較(±s)

表6 各組小鼠自然殺傷細胞活性、脾上清液中IFN-γ含量、脾上清液中IL-10含量比較(±s)

注:*P＜0.05，表示柴胡龍牡湯組小鼠脾上清液自然殺傷細胞活性、小鼠脾上清液中IFN-γ含量及小鼠脾上清液中IL-10含量與模型組、順鉑化療組、恩度聯(lián)合NP治療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)小鼠脾上清液自然殺傷細胞活性(%)小鼠脾上清液中IFN-γ含量(pg/ml)小鼠脾上清液中IL-10含量(pg/ml)0.02 10 14.68 ±2.05 50.71 ±10.09 148.51 ±29.41恩 度 聯(lián) 合 NP 對 照 組 15.00 10 13.23 ±1.99 57.63 ±11.87 133.54 ±18.77模 型 組 400.00 10 19.36 ±0.02 49.51 ± 6.59 153.28 ±33.08柴 胡 龍 牡 湯 組 400.00 10 52.45 ±0.16 65.87 ±17.86 117.31 ±11.62順鉑化療對照組*

表7 各組小鼠的脾臟T淋巴細胞亞群的比較(±s)

表7 各組小鼠的脾臟T淋巴細胞亞群的比較(±s)

注:*P＜0.05，表示柴胡龍牡湯組CD4+、CD4+/CD8+的比值模型組、順鉑放射組、恩度聯(lián)合NP治療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義

組別 劑量(mg/d)樣本數(shù)(n)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+順 鉑 化 療 對 照 組0.02 10 13.21 ±1.81 16.71 ±1.59 0.88 ±0.24恩 度 聯(lián) 合 NP 對 照 組 15.00 10 15.18 ±1.87 16.62 ±1.03 0.93 ±0.17模 型 組 400.00 10 9.13 ±2.21 14.59 ±3.31 0.64 ±0.46柴 胡 龍 牡 湯 組 400.00 10 22.25 ±6.79* 15.52 ±4.45 1.41 ±0.36*

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用柴胡龍牡湯組在減輕Lewis肺癌瘤體的質(zhì)量、抑制腫瘤肺組織轉(zhuǎn)移、降低腫瘤細胞的增殖能力方面與模型組比較差異顯著，但與順鉑等化療藥物比較差異顯著，提示柴胡龍牡湯在抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移方面不如化療藥物。這可能與中藥的多靶點多途徑而作用點不集中有關(guān)，也可能與實驗周期短有關(guān)。而在提高脾臟的自然殺傷細胞活性和IFN-γ含量、降低脾臟中IL-10含量方面，與采用生理鹽水治療的模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，也高于于順鉑化療組和恩度聯(lián)合NP治療組。柴胡龍牡組T淋巴細胞的CD4+、CD4+/CD8+和模型組、順鉑放射組和恩度聯(lián)合NP對照組比較差異顯著。說明柴胡龍牡湯對Lewis肺癌的抑制作用，可能不是直接針對癌細胞，而是通過調(diào)整免疫、扶助“正氣”并能夠避免化療帶來的損傷正常免疫細胞和引起炎癥反應(yīng)的副作用，從而抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移，其具體作用機制有待進一步研究。

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