王文娟，趙 丹，徐 靜，李 麗，董 謙，王玉鳳，馮巧靈，王 錦，何娟文，何通川，羅進勇

(重慶醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學教育部重點實驗室 重慶市重點實驗室, 重慶 400016)

研究論文

雙氫青蒿素通過阻斷Wnt/β-catenin信號抑制骨肉瘤細胞系體外增殖和侵襲

王文娟，趙 丹，徐 靜，李 麗，董 謙，王玉鳳，馮巧靈，王 錦，何娟文，何通川，羅進勇*

(重慶醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 檢驗醫(yī)學教育部重點實驗室 重慶市重點實驗室, 重慶 400016)

目的研究雙氫青蒿素(DHA)在體外對骨肉瘤細胞增殖和侵襲的抑制作用及其可能的分子機制。方法不同濃度的DHA處理骨肉瘤細胞，結(jié)晶紫染色檢測細胞增殖。Western blot和熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測Wnt/β-catenin信號通路的活化情況。結(jié)果DHA在體外能明顯濃度依賴性地抑制人骨肉瘤細胞的增殖和侵襲(P<0.05)；DHA可降低骨肉瘤細胞β-catenin的蛋白水平和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(P<0.01)，過表達β-catenin可逆轉(zhuǎn)DHA對骨肉瘤細胞增殖和侵襲的抑制作用(P<0.05)，而β-catenin基因沉默則可進一步加強其抑制效果(P<0.01)。結(jié)論DHA可明顯抑制人骨肉瘤細胞增殖和侵襲，這種作用可能與其阻斷Wnt/β-catenin信號通路相關。

雙氫青蒿素；骨肉瘤；Wnt/β-catenin；信號通路

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常見的惡性成骨性腫瘤之一，尤其好發(fā)于兒童和青少年[1]。骨肉瘤惡性程度較高。有80%的患者在確診時就已經(jīng)出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移[2]。目前骨肉瘤的臨床治療面臨諸多挑戰(zhàn)，如化療藥物的不良反應、腫瘤細胞耐藥、腫瘤復發(fā)和肺部轉(zhuǎn)移等。即使采取以手術(shù)為主，輔以化療和放療的綜合治療，其預后仍然不佳[3]。因此，臨床需要更為低毒有效的藥物用于骨肉瘤的治療。開發(fā)新的治療藥物或新的治療藥物與傳統(tǒng)治療方式相結(jié)合是骨肉瘤治療的重要研究方向，

青蒿素是菊科植物黃花蒿中的有效成分，而雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)是由青蒿素經(jīng)四氫硼鈉還原而成的一個重要衍生物。目前DHA作為治療瘧疾的一線藥物在臨床廣為使用[4]。近來研究發(fā)現(xiàn)，DHA對于多種惡性腫瘤均具有明顯的抑制作用，且不良反應較小[5- 7]。本實驗對DHA在體外抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲的作用進行了研究，并進一步探討了其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光素酶報告質(zhì)粒Top-luc、過表達β-catenin腺病毒和β-catenin的RNA干擾腺病毒(芝加哥大學醫(yī)學中心何通川教授惠贈)；人骨肉瘤細胞系143B、MG63、SaoS2和U2OS(美國菌種保藏中心ATCC)；DHA(四川三奇制藥廠)，DMSO溶解為濃度為70 mmol/L的原液，-20 ℃保存?zhèn)溆?；DMEM高糖培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清(Hyclone公司)?？贵w：MMP9(sc-6840)、VEGF(sc-7269)、COX2(sc-65239)、p-P53(sc-18078)、P53(sc-126)、MDM2(sc-965)、c-Myc(sc-41)、Cyclin D1(sc-8396)、β-catenin(sc-7963)、DVL(sc-7400)、p-GSK3β(Ser9)(sc-373800)、GSK3(sc-81402)和β-actin(sc-47778)一抗(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)晶紫染色：將143B、MG63、SaoS2和U2OS細胞制備為5×104個/mL的細胞懸液。在24孔板中，每孔加入500 μL細胞懸液，貼壁后按預定分組處理。處理結(jié)束后，棄去上清，PBS洗滌兩次，醋酸/甲醇固定液(1∶3)固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，流水沖洗多余染液，自然干燥后成像。隨后，加入20%醋酸溶液1 mL，在室溫下振蕩處理20 min，吸取其中100 μL液體加至1 mL蒸餾水中，570 nm下測定吸光度。計算腫瘤細胞的相對生長速率(DHA處理組吸光度/DMSO處理組吸光度×100%)。

1.2.2 Transwell實驗：按1∶7比例將基質(zhì)膠(extracellular matrix，ECM)與預冷的無血清培養(yǎng)基充分混合，吸取32 μL混合液均勻鋪在Transwell小室內(nèi)側(cè)面。無血清培養(yǎng)基制備2.5×105個/mL細胞懸液，吸取400 μL細胞懸液加入小室內(nèi)。24孔板內(nèi)加入含20%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)600 μL，培養(yǎng)24 h。濕棉簽檫去小室未穿過膜的細胞，無水乙醇室溫固定20 min，自然晾干后，蘇木精染色20 min，清水漂洗，自然晾干。伊紅復染20 min，自然干燥后成像。

1.2.3 Western blot：細胞接種在直徑100 mm的培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后加入不同處理因素處理，到相應時間后提取細胞蛋白，按照Western blot步驟測定相應蛋白的變化。

1.2.4 熒光素酶報告基因的檢測：將143B細胞接種于T-25細胞培養(yǎng)瓶中，濃度為30%，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染Top-luc 質(zhì)粒3 μg，隨后加入DHA處理至不同時間點后測定熒光素酶活性(按照試劑盒說明書進行)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DHA抑制人骨肉瘤細胞的增殖

即使低劑量的DHA(2.5 μmol/L)也可抑制143B細胞增殖(P<0.05)，而且隨著DHA濃度的增加，對143B細胞的增殖抑制作用越強(P<0.05，P<0.01)(圖1)。在骨肉瘤細胞系MG63、SaoS2和U2OS中，DHA也表現(xiàn)出相似的抑制骨肉瘤細胞增殖的作用(P<0.05，P<0.01)(圖2)。

2.2 DHA抑制人骨肉瘤細胞的侵襲

DHA組穿過小室的細胞明顯減少(P<0.01)(圖3A, B)。DHA可以下調(diào)腫瘤侵襲相關蛋白如基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)的蛋白水平(圖3C)。

A.cell proliferation (crystal violet staining) result of 143B OS cells treated with DHA as the indicated concentrations; B.the quantitative result of crystal violet staining of 143B cells;*P<0.05,**P<0.01 compared with blank and DMSO

圖1DHA抑制骨肉瘤細胞143B的增殖
Fig1DHAinhibitstheproliferationof143BOScells

A.cell proliferation (crystal violet staining) result of MG63，SaoS2 and U2OS cells treated with DHA as the indicated concentrations; B.the quantitative result of crystal violet staining MG63，SaoS2 and U2OS cells；*P<0.05,**P<0.01 compared with blank and DMSO

圖2DHA抑制骨肉瘤細胞MG63、SaoS2和U2OS的增殖
Fig2DHAinhibitstheproliferationofMG63，SaoS2andU2OScells

2.3DHA可阻斷骨肉瘤細胞中Wnt/β-catenin信號通路

經(jīng)典的腫瘤相關分子p-P53、P53和MDM2均未發(fā)生明顯變化。但DHA處理使β-catenin蛋白在骨肉瘤細胞內(nèi)明顯減少，β-catenin靶蛋白c-Myc和cycling D1的蛋白水平也相應下降；Wnt/β-catenin信號通路中調(diào)節(jié)β-catenin蛋白水平的重要分子DVL的蛋白水平以及GSK3β的磷酸化水平均明顯下調(diào)(圖4 A)。而且β-catenin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性也明顯被DHA所抑制(P<0.01)(圖4 B)。

2.4Wnt/β-catenin信號通路與DHA抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲相關

在143B細胞中成功過表達β-catenin(圖5A)或?qū)Ζ?catenin進行基因沉默(圖5B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨過表達β-catenin，143B的增殖和侵襲均無明顯變化，但過表達β-catenin可以逆轉(zhuǎn)DHA對于骨肉瘤細胞的抑制作用(P<0.05)，使得細胞的增殖和侵襲能力得到一定程度恢復(圖6)；而僅有β-catenin基因沉默時，143B的增殖和侵襲就有所下降(P<0.05)，不僅如此，β-catenin基因沉默可以進一步加強DHA對于143B的增殖和侵襲的抑制作用(P<0.01)(圖6)。

3 討論

骨肉瘤原發(fā)于骨組織，其致死率和致殘率較高。

A.the transwell migration assay in 143B cells treated with DHA as the indicated concentrations (×100); B.the quantitative result of transwell migration assay in 143B cells；*P<0.01 compared with blank and DMSO; C.Western blot assay for the MMP9, VEGF and COX2 protein level in 143B cells

圖3DHA抑制骨肉瘤細胞143B的侵襲
Fig3DHAinhibitsmigrationandinvasionof143BOScells

A.Western blot assay for p-P53, P53, MDM2, β-catenin, C-myc, Cyclin D1, DVL, p-GSK3β (Ser 9) and GSK3β protein level in 143B cells; B.β-catenin-controlled TOP-luc reporter result in 143B cells;*P<0.01 compared with blank and DMSO

圖4DHA抑制骨肉瘤細胞143B的Wnt/β-catenin信號通路
Fig4DHAsuppressesWnt/β-cateninsignalinginhuman143BOScells

A.Western blot assay for exogenous β-catenin in 143B cells; B.Western blot assay for knockdown of β-catenin in 143B cells

圖5在143B細胞中有效過表達β-catenin及沉默β-catenin

Fig5Theeffectiveexpressionofexogenousβ-cateninandgenesilenceofβ-cateninin143BcellsconfirmedbyWesternblotassay

A.the quantitative result of 143B growth rate (crystal violet staining) treated by DHA with/without exogenous expressed β-catenin or knockdown of β-catenin；*P<0.05，**P<0.01 compared with DMSO;#P<0.05，##P<0.01 compared with DHA; B.the transwell invasion result (with EMC) in 143B cells treated by DHA with/without exogenous expressed β-catenin or knockdown ofβ-catenin(×100); C.the quantitative transwell invasion result in 143B cells treated by DHA with/without exogenous expressed β-catenin or knockdown ofβ-catenin；*P<0.05，**P<0.01 compared with DMSO；#P<0.01 compared with DHA

圖6DHA對骨肉瘤細胞增殖和侵襲的抑制與β-catenin有關
Fig6β-cateninfunctionsintheinhibitoryeffectofDHAonOScells

在采用傳統(tǒng)的手術(shù)、化療和放療后，骨肉瘤的預后仍不佳。天然藥物和中藥有效成分已視為是高效低毒的抗腫瘤藥物的理想來源。近來發(fā)現(xiàn)抗瘧疾藥物DHA也具有抗腫瘤的效果[5- 7]。已證實DHA抗腫瘤的機制可能涉及體內(nèi)鐵的平衡[6]，并與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)中的P38和ERK1/2信號通路相關[7]。本研究則發(fā)現(xiàn)，DHA可以明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲， 該抑制作用可能是通過阻斷Wnt/β-catenin信號而實現(xiàn)的。

本研究表明經(jīng)典的腫瘤相關分子p-P53、P53和MDM2可能與DHA的抗骨肉瘤細胞增殖和侵襲無關。Wnt/β-catenin信號在腫瘤的發(fā)生中具有重要的作用[8- 10]。而DHA可以抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號，導致β-catenin在細胞內(nèi)水平下降，并抑制其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。DHA可以抑制DVL的蛋白水平，DVL是調(diào)控β-catenin水平的重要分子，其受到抑制后，將會影響β-catenin降解復合物的形成，從而抑制復合物對于β-catenin的降解[9]。GSK3β可以直接磷酸化β-catenin，導致其降解。GSK3β在第9位絲氨酸磷酸化，會導致GSK3磷酸化β-catenin的活性減弱[10]。而DHA則可抑制GSK3β的第9位絲氨酸磷酸化，導致GSK3β催化活性增加。由此推斷DHA極可能通過下調(diào)DVL蛋白水平，并通過抑制GSK3β的第9位絲氨酸磷酸化而促進GSK3β的催化活性，從而促進β-catenin降解，下調(diào)β-catenin在細胞內(nèi)的蛋白水平，并由此抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲。

本研究主要的意義在于探討了DHA抑制骨肉瘤細胞的分子機制，發(fā)現(xiàn)了DHA抗腫瘤活性與阻斷腫瘤細胞Wnt/β-catenin信號通路有關，在一定程度上為DHA抗腫瘤的應用提供了理論和實驗基礎。

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Dihydroartemisinin (DHA) inhibits proliferation and invasion ofosteosarcoma cell lineinvitroby suppressing Wnt/β-catenin signaling

WANG Wen-juan, ZHAO Dan, XU Jing, LI Li, DONG Qian, WANG Yu-feng, FENG Qiao-ling,WANG Jin, HE Juan-wen, HE Tong-chuan, LUO Jin-yong*

(Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics, Ministry of Education, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

ObjectiveTo investigate the proliferation and invasion inhibitory effect of dihydroartemisinin (DHA) on human osteosarcoma (OS) cells and the possible molecular mechanism involved.MethodsOS cells were seeded and treated with different concentrations of DHA. Cells were stained with crystal violet to find cell viability. ECM Transwell assay was used to assess the alteration in cellular invasion induced by DHA in OS cells. Western blot and luciferase assay were used to evaluate activation of Wnt/β-catenin signal pathway.ResultsDHA can inhibit proliferation and reduce invasion in human OS cells. Total protein and transcription activity of β-catenin in OS cells were reduced by DHA treatment. Moreover, the inhibitory effect of DHA on OS cells was reversed by over-expression ofβ-catenin, but was further enhanced by know-down of β-catenin, respectively.ConclusionsOur results showed that DHA can inhibit tumor proliferation and invasion of OS cells by inactivating Wnt/β-catenin signaling.

dihydroartemisinin; osteosarcoma; Wnt/β-catenin; signal pathway

2013- 08- 26

2013- 12- 20

國家自然科學基金(31071304，81272006)；973子課題(2011CB707906)

*通信作者(correspondingauthor)： luojinyong@sina.com

1001-6325(2014)08-1017-06

R 743.2

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