郝錦玲，劉 琳，蔣蘭萍，施瀟瀟，文煜冰，李榮山，陳麗萌*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 腎內(nèi)科，北京 100730； 2.山西醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，山西 太原 030000)

#對本文有相同貢獻(xiàn)

研究論文

A1AR在低鹽刺激小鼠腎素分泌中的可能作用

郝錦玲1,2 #，劉 琳1#，蔣蘭萍1，施瀟瀟1，文煜冰1，李榮山2，陳麗萌1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 腎內(nèi)科，北京 100730； 2.山西醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，山西 太原 030000)

目的觀察腺苷A1型受體(A1AR)基因敲除小鼠的病理生理特點(diǎn)及A1AR在慢性低鹽刺激腎素分泌中的作用。方法C57BL/6J品系A(chǔ)1AR基因敲除雜合子(A1AR+/-)小鼠，經(jīng)繁殖及基因鑒定后，雜合子子代小鼠用于擴(kuò)大繁殖，A1AR+/+小鼠(n=13)及A1AR-/-小鼠(n=14)用于實(shí)驗(yàn)。觀察兩組小鼠生長發(fā)育、基本生理情況(血壓、心率、腎功能和血尿電解質(zhì))、腎臟病理和免疫組化觀察腎臟局部腎素表達(dá)和檢測血漿醛固酮水平(A1AR+/+組n=5，A1AR-/-組n=5)。結(jié)果低鹽飲食后，A1AR-/-小鼠腎皮質(zhì)腎素表達(dá)明顯增加(Plt;0.05)，全身醛固酮水平和24 h尿鉀排泄量顯著高于A1AR+/+小鼠(Plt;0.05)。結(jié)論A1AR可能參與了低鹽刺激小鼠腎素分泌的過程。

低鹽飲食；A1AR；腎素

腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system, RAS)是機(jī)體調(diào)節(jié)水鹽平衡和血壓最重要的激素，其中腎素作為第1個(gè)限速酶起到關(guān)鍵作用，90%的腎素由腎臟腎小球旁器 (juxtaglomerular apparatus, JGA)

顆粒細(xì)胞分泌。低鹽是調(diào)節(jié)腎素分泌的三大經(jīng)典機(jī)制之一，它主要通過腎臟腎小球旁器致密斑途徑刺激腎素分泌。低鹽還降低致密斑分泌ATP代謝的最終產(chǎn)物腺苷(adenosine，A),減少腎小球入球動(dòng)脈其A1型腺苷受體(A1 adenosine receptor，A1AR)的活化，舒張入球動(dòng)脈，通過管球反饋(tubuloglomerular feedback, TGF)調(diào)節(jié)水鹽平衡[1-2]。然而腺苷及其受體通過TGF和腎素旁分泌兩大途徑調(diào)節(jié)血壓的機(jī)制尚不清楚，國內(nèi)因?yàn)槿狈ρ芯科脚_(tái)，鮮有相關(guān)的研究，本研究引進(jìn)A1AR-/-小鼠，觀察低鹽飲食下，該基因敲除小鼠的病理生理特點(diǎn)及A1AR在慢性低鹽刺激腎素分泌中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 A1AR基因敲除動(dòng)物的引進(jìn)與育種

C57BL/6J品系A(chǔ)1AR基因敲除雜合子(A1AR+/-)小鼠經(jīng)繁殖及鑒定后的子代小鼠用于擴(kuò)大繁殖及實(shí)驗(yàn)。根據(jù)《中華人民共和國進(jìn)出境動(dòng)植物檢疫法》及《進(jìn)出境動(dòng)物臨時(shí)隔離檢疫場管理辦法》要求，對引進(jìn)小鼠進(jìn)行為期30d的隔離檢疫，檢疫結(jié)果合格，微生物控制級別符合中國SPF級小鼠要求。按照SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)程將小鼠置于動(dòng)物房獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具內(nèi)，室內(nèi)溫度18～22 ℃，濕度50%左右，日光照明。采用1只雄性A1AR+/-小鼠與2只雌性A1AR+/-小鼠同居的方式進(jìn)行繁殖。記錄種鼠產(chǎn)仔率，在仔鼠7～14 d 齡期間對其進(jìn)行剪指法編號(hào)，同時(shí)留取剪掉的指端標(biāo)本用于基因鑒定。

1.2 A1AR基因敲除小鼠的基因鑒定

表1 用于基因鑒定的A1AR和NeoR基因引物序列Table 1 Primer sequence of A1AR and NeoR for genotyping

圖1 小鼠DNA鑒定部分結(jié)果Fig 1 Results of partial DNA identification

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)和分組

A1AR+/+小鼠(n=13)和A1AR-/-小鼠(n=14)小鼠置于北京協(xié)和醫(yī)院SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件同前，飼料由北京科奧協(xié)利飼料有限公司提供，正常鹽飼料(含NaCl 0.3%，K 0.6%)飼養(yǎng)4周后更換為低鹽飲食(含NaCl 0.03%, K 0.6%)。實(shí)驗(yàn)第8周處死小鼠。

1.4 血清生化和血漿醛固酮水平的檢測

使用內(nèi)眥靜脈叢采血法取得全血，靜置2 h后以室溫8 000r/min離心10 min，使用全自動(dòng)生化儀器檢測肌酐、尿素氮、尿酸、鈉、鉀、氯、血糖及三酰甘油等生化指標(biāo)，其中常規(guī)用酶法檢測血肌酐，脲酶法檢測血尿素氮，尿酸酶法檢測血尿酸。部分肝素抗凝血，分離血漿后，放射性免疫的方法測定血漿醛固酮含量[碘(125I)醛固酮放射免疫分析藥盒]。

1.5 小鼠尾動(dòng)脈血壓及脈搏的檢測

在小鼠清醒狀態(tài)下，使用小鼠無創(chuàng)血壓分析系統(tǒng)BP2000(visitech公司)測定其尾動(dòng)脈收縮壓、舒張壓及脈搏。該系統(tǒng)采用光電容積脈搏波描記法(photoplethysmography)通過感受尾部血管擴(kuò)張和收縮時(shí)吸收的光的變化記錄血管壓力的改變，同時(shí)計(jì)數(shù)脈搏，連續(xù)3d每日相同時(shí)間測量小鼠血壓10次，計(jì)算每只小鼠有效收縮壓、舒張壓及脈搏數(shù)據(jù)的平均值作為該小鼠該次測量結(jié)果。

1.6 24 h尿離子排泄量的檢測

實(shí)驗(yàn)過程持續(xù)約1個(gè)月，設(shè)計(jì)師定期提交作品并集中展示，管理者根據(jù)提交作品的評價(jià)和引用情況畫出協(xié)作網(wǎng)絡(luò)圖張貼在展示區(qū)供參考。對設(shè)計(jì)師提交作品的數(shù)量無強(qiáng)制要求。

小鼠特制代謝籠(MMC100 metabolic cage, hatteras instruments inc.USA)中飼養(yǎng)小鼠，不限食和飲水。24 h后收集所有尿液，常溫下7 000r/min離心10 min，-80 ℃保存用于后續(xù)檢測,檢測方法同血標(biāo)本。

1.7 腎臟病理標(biāo)本的處理及觀察

腹腔注射1%水合氯醛(300～400 mg/kg)麻醉處死小鼠，低溫解剖快速分離單側(cè)腎臟皮質(zhì)，液氮快速凍存后，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。另一?cè)腎臟使用4%甲醛固定腎組織標(biāo)本48 h以上，常規(guī)進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片,行HE、PAS染色。使用Olympus光學(xué)顯微鏡分別在100、200及400倍鏡下觀察，并用Nikon Digital Sight圖像采集系統(tǒng)在相同條件下拍照，收集圖像信息。

1.8 腎素免疫組化的染色

石蠟切片(厚度3 μm)脫蠟水化后，枸櫞酸鹽pH 6.0緩沖液高壓修復(fù)3 min。用10%正常兔血清封閉非特異性染色60 min。加1∶200稀釋的綿陽抗腎素抗體(AF4090,Ramp;D Systems公司)4 ℃孵育過夜，TBS洗3次。再用3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，TBS洗3次。滴加1∶500稀釋的辣根酶標(biāo)記兔抗綿羊二抗(E030150，EarthOx公司)。用DAB顯色，蘇木素復(fù)染核，中性樹膠封片，具體方法見本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)[3]，置顯微鏡下觀察，利用Olympus光學(xué)顯微鏡和Nikon Digital Sight圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行拍照。使用Image Pro Plus軟件6.0版本進(jìn)行圖片分析，計(jì)算平均每個(gè)腎小球腎素陽性腎小球旁器區(qū)域面積和腎素陽性腎小球旁器與腎小球個(gè)數(shù)的比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠繁殖及生長情況

雌A1AR+/-小鼠孕期3～4周，每窩產(chǎn)仔6～10只，哺乳期3周。仔鼠雌雄比例約為1∶1。A1AR+/-、A1AR-/-與A1AR+/+C57BL/6J小鼠相比，生長發(fā)育及生活習(xí)性無明顯差異。不同基因型雄鼠與雜合子雌鼠交配繁育后代的基因情況經(jīng)過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，基本符合孟德爾定律(χ2=0.17,P=0.68)(表2)。仔鼠出生2周齡進(jìn)行標(biāo)號(hào)，標(biāo)號(hào)后至2月齡之內(nèi)，A1AR+/+仔鼠死亡3只(4.91%)，A1AR-/-仔鼠死亡2只(4.65%)，二者無顯著差異。選用基因型為A1AR+/+和A1AR-/-的小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同基因型小鼠交配后子代的比例

2.2 一般情況和血生化指標(biāo)

自然生長過程中，各個(gè)周齡A1AR-/-與A1AR+/+小鼠質(zhì)量之間無差異，在2～6周質(zhì)量處于快速增長期，15周以后，質(zhì)量變化不大(圖2)。其中2周齡A1AR+/+小鼠n=18，A1AR-/-小鼠n=11；6周齡A1AR+/+小鼠n=12，A1AR-/-小鼠n=8；10周齡A1AR+/+小鼠n=25，A1AR-/-小鼠n=10；15周齡A1AR+/+小鼠n=6，A1AR-/-小鼠n=5；20周齡A1AR+/+小鼠n=5，A1AR-/-小鼠n=5。

正常鹽飲食和低鹽飲食2周后，A1AR-/-小鼠基礎(chǔ)收縮壓、舒張壓及心率與周齡匹配的A1AR+/+小鼠無顯著差異。同組小鼠，低鹽飲食兩周后收縮壓和舒張壓也無明顯差異(表3)。

2.3 腎臟病理的特點(diǎn)

20周時(shí)腎臟HE染色和PAS染色，A1AR+/+和A1AR-/-小鼠的腎小球、腎小管間質(zhì)和血管等無明顯差異(圖3)。

圖2 A1AR+/+和A1AR-/-小鼠在各周齡的體質(zhì)量Fig 2 Body weight of A1AR+/+ and A1AR-/- mice at different ages

低鹽飲食下，A1AR-/-小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)的腎功能、血清尿酸、電解質(zhì)、血糖、血脂水平與A1AR+/+小鼠無顯著差異(表4)。

2.4 低鹽飲食小鼠腎臟腎素表達(dá)的差異

A1AR-/-與A1AR+/+小鼠低鹽飲食4周，免疫組化染色可見A1AR-/-小鼠腎皮質(zhì)腎素表達(dá)增加(圖4)。半定量分析顯示，A1AR-/-小鼠腎皮質(zhì)平均腎素陽性腎小球旁器區(qū)域面積和比例顯著高于A1AR+/+小鼠(Plt;0.05)(圖5)。

2.5 兩組小鼠血漿醛固酮及尿電解質(zhì)排泄量

正常鹽飲食組，A1AR+/+與A1AR-/-兩組小鼠的血漿醛固酮水平接近；低鹽飲食組，A1AR-/-小鼠的血漿醛固酮水平顯著高于A1AR+/+小鼠(Plt;0.01)(圖6A)。低鹽飲食對24 h尿Na+和Cl-的排泄量無明顯影響，但A1AR-/-小鼠的K+排泄量明顯高于A1AR+/+小鼠(Plt;0.05)(圖6B)。

3 討論

本研究觀察到A1AR-/-小鼠在低鹽狀態(tài)下RAS的進(jìn)一步活化，提示A1AR可能參與了低鹽刺激腎素分泌過程中的反饋機(jī)制。低鹽促使腎素分泌的機(jī)制首先是容量降低通過壓力感受器直接刺激腎素分泌，上調(diào)血管緊張素和醛固酮水平，從而促使遠(yuǎn)端小管和集合管重吸收鈉增加，促進(jìn)容量的恢復(fù)；其次，低容量使到達(dá)遠(yuǎn)端腎小管致密斑的Na+和Cl-濃度降低，通過激動(dòng)COX2和抑制nNOS的旁分泌途徑，促使入球小動(dòng)脈壁的腎小球旁器顆粒細(xì)胞分泌腎素，相關(guān)機(jī)制分別在體外實(shí)驗(yàn)、COX2和nNOS基因敲除小鼠中得到證實(shí)[4-5]。在致密斑途徑中，因?yàn)镹aCl主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)減少，消耗的ATP降低，腺苷產(chǎn)生減少，TGF反應(yīng)降低，擴(kuò)張入球小動(dòng)脈，而主要受血管緊張素Ⅱ調(diào)節(jié)的出球動(dòng)脈收縮，單個(gè)腎小球的濾過率(glomerular filtration rate, GFR)增加，改善遠(yuǎn)端小管內(nèi)的低鈉和低氯狀態(tài)；A1AR基因缺失，低鹽對入球動(dòng)脈的調(diào)節(jié)作用消失[6-8]，腎小球的灌注和遠(yuǎn)端小管鈉和氯離子濃度不能恢復(fù)，促使致密斑刺激腎素分泌的機(jī)制持續(xù)存在，故腎小球旁器腎素及其下游醛固酮增加，尿鉀排出增加。此外，有研究表明，分泌腎素的腎小球旁器顆粒細(xì)胞上有A1AR受體表達(dá)，其活化會(huì)直接抑制腎素分泌，A1AR基因敲除，其抑制作用消失，腎素表達(dá)也會(huì)增加。本研究還在低鹽的A1AR基因敲除小鼠中觀察到JGA細(xì)胞之外的球外系膜細(xì)胞和小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞均有腎素表達(dá)， 筆者在遺傳性失鹽性腎病Gitelman綜合征也觀察到類似情況，從而證實(shí)了低鹽促使腎素上調(diào)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

表3 不同飲食時(shí)兩組小鼠的血壓和心率Table 3 The blood pressure and heart rate between A1AR+/+ and A1AR-/-mice with different diets

表4 A1AR+/+及A1AR-/-小鼠血清電解質(zhì)及腎功能Table 4 The serum electrolytes, renal function in A1AR+/+ and A1AR-/- mice

A.A1AR+/+mice(HE×100)；B.A1AR-/-mice(HE×100)；C.A1AR+/+mice(HE×200)；D.A1AR-/-mice(HE×200)；E.A1AR+/+mice(PAS×100)；F.A1AR-/-mice(PAS×100)；G.A1AR+/+mice(PAS×200)；H.A1AR-/-mice(PAS×200)

圖320周時(shí)兩組小鼠的腎臟病理
Fig3Kidneypathologypictureat20weeksoldintwogroupsofmice

A.A1AR+/+ mice(×100)；B.A1AR-/- mice(×100)；C A1AR+/+ mice(×400)；D A1AR-/- mice(×400)圖4 免疫組化分析腎臟皮質(zhì)腎素表達(dá)Fig 4 Immunohistochemical localization of renin in nephron cortex

A.the ratio of positive area of renin and glomerulus quantity；B.the percentage of JGA quantity of positive renin and glomerulus quantity；*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with A1AR+/+group

圖5免疫組化腎素表達(dá)半定量分析
Fig5ThesemiquantitativeanalysisofImmunohistochemicallocalizationofreninexpression(n=4)

A.plasma aldosterone of two group mice in different diets; B.urine electrolyte excretion during 24 hours of two group mice in low salt diet;*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with A1AR+/+group

圖6兩組小鼠的血漿醛固酮及尿電解質(zhì)排泄
Fig6Plasmaaldosteroneandurineelectrolyteexcretionduring24hoursinA1AR+/+andA1AR-/-mice(n=5)

與文獻(xiàn)報(bào)告相似，盡管RAS活化，A1AR-/-小鼠腎臟血壓并沒有顯著的變化[5，9]，影響血壓的因素很多，腎素活化并不是決定血壓的唯一因素，相對容量的變化可能更為重要，低鹽本身是WHO推薦飲食控制血壓的重要措施。事實(shí)上長期低鹽飲食，會(huì)下調(diào)激活RAS的鈉和氯調(diào)定點(diǎn)，達(dá)成新的平衡。遺憾的是這方面的研究并不多，需要更多的證據(jù)來闡明其機(jī)制，而利用A1AR-/-小鼠對于更深入研究管球反饋對腎素調(diào)控，及其下游血壓和水鹽的調(diào)節(jié)作用有重要幫助。

[1] Osswald H, Vallon V, Muhlbauer B. Role of adenosine in tubuloglomerular feedback and acute renal failure[J]. J Auton Pharmacol, 1996, 16: 377-380.

[2] Schnermann J. Juxtaglomerular cell complex in the regulation of renal salt excretion[J]. Am J Physiol,1998, 274: 263-279.

[3] Chen L, Faulhaber-Walter R, Wen Y,etal. Renal failure in mice with Gsalpha deletion in juxtaglomerular cells[J]. Am J Nephrol, 2010, 32: 83-94.

[4] Kim SM, Chen L, Mizel D,etal. Low plasma renin and reduced renin secretory responses to acute stimuli in conscious COX-2-deficient mice[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 292: 415-422.

[5] 陳麗萌，黃宇寧，秦巖，等. 前列腺素E2在腎臟球旁器調(diào)節(jié)腎素分泌中的作用[J]. 中華腎臟病雜志,2009, 25:217-221.

[6] Nishiyama A, Inscho EW, Navar LG. Interactions of adenosine A1 and A2a receptors on renal microvascular reactivity[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2001, 280: 406-414.

[7] Ren Y, Arima S, Carretero OA,etal. Possible role of adenosine in macula densa control of glomerular hemodynamics[J]. Kidney Int,2002, 61: 169-176.

[8] Hashimoto S, Huang Y, Briggs J,etal. Reduced autoregulatory effectiveness in adenosine 1 receptor-deficient mice[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2006, 290: 888-891.

[9] Lai EY, Martinka P, Fahling M,etal. Adenosine restores angiotensin Ⅱ-induced contractions by receptor-independent enhancement of calcium sensitivity in renal arterioles[J]. Circ Res, 2006, 99: 1117-1124.

Potential role of A1AR in renin secretion stimulated by low salt diet in mice

HAO Jin-ling1,2#, LIU Lin1#, JIANG Lan-ping1, SHI Xiao-xiao1, WEN Yu-bing1,LI Rong-shan2, CHEN Li-meng1*

(1.Dept. of Nephrology, CAMS amp; PUMC, Beijing 100730；2.Dept. of Nephrology, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030000,China)

ObjectiveTo observe the pathogenesis of adenosine A1 receptor (A1AR) gene knockout mice and to investigate the role of A1AR in renin secretion stimulated by low salt diet.MethodsAfter A1AR+/-mice of C57BL/6J mating, multiplication and gene identification, offspring mice were sampled. The differences of following items between A1AR+/+(n=13)and A1AR-/-(n=14)mice were recorded: body weight, blood pressure, heart rate, renal function and electrolyte profile of serum and urine; Pathology features were microscopied after regular staining on kidney tissue samples. Renin expression at the kidney was stained by Immunohistochemistry. Plasma aldosterone level was also examined(A1AR+/+group,n=5,A1AR-/-groupn=5).ResultsAfter low salt diet, much higher renin expression of the kidney cortex and plasma aldosterone level was observed in A1AR-/-mice, accompanied with increasing of 24-hour urine potassium excretion (Plt;0.05).ConclusionsA1AR may mediate the renin secretion stimulated by low salt diet in mice.

low salt diet; A1AR; renin

2014-01-09

2014-03-12

科技部973項(xiàng)目(2012CB517803)，國家自然科學(xué)基金(81170674,30971369)

*通信作者(correspondingauthor)：chenlpumch@163.com

1001-6325(2014)05-0615-07

R 322.6

A