邢譯文，白 靜，范維寧，劉 鑫，周林林，徐廣賢,2*

(寧夏醫(yī)科大學 1.檢驗學院; 2.總醫(yī)院 醫(yī)學實驗中心，寧夏 銀川 750004)

OPN siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對大腸癌細胞增殖的抑制作用

邢譯文1，白 靜1，范維寧1，劉 鑫1，周林林1，徐廣賢1,2*

(寧夏醫(yī)科大學 1.檢驗學院; 2.總醫(yī)院 醫(yī)學實驗中心，寧夏 銀川 750004)

目的構(gòu)建OPN-siRNA的慢病毒載體，探討其對結(jié)腸癌SW480細胞增殖的調(diào)節(jié)作用。方法設計合成針對OPN的siRNA序列，退火形成雙鏈DNA并克隆到pSicoR質(zhì)粒后，包裝重組慢病毒。應用Real-time PCR及Western blot檢測病毒刺激SW480細胞后OPN的mRNA和蛋白的表達水平，應用MTT法檢測慢病毒對SW480細胞增殖的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果成功構(gòu)建了攜帶OPN-siRNA的重組慢病毒。該重組慢病毒可使SW480細胞內(nèi)OPN的mRNA和蛋白的表達降低，LV-siRNA-OPN慢病毒對SW480細胞增殖有明顯的抑制作用(Plt;0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建的LV-siRNA-OPN慢病毒可以有效抑制SW480細胞內(nèi)OPN的mRNA和蛋白表達， 并抑制SW480細胞的增殖。

OPN； siRNA；慢病毒；SW480細胞

骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種具有多種功能的分泌型Ⅰ鈣結(jié)合磷酸化糖蛋白，OPN分布廣泛，并受多種因素的調(diào)控，能與多種物質(zhì)結(jié)合，發(fā)揮不同的生物學作用。近年來有大量的研究表明，OPN可以參與腫瘤細胞的黏附、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程，是一種與諸多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白質(zhì)[1]。其表達水平與腫瘤的惡性程度、預后和復發(fā)也具有密切的關(guān)系[2]。揭示OPN作為一個重要的腫瘤相關(guān)因子，具有重要的臨床意義。RNA干擾技術(shù)(RNA interference，RNAi)是近年來被公認的研究基因功能最重要的技術(shù)之一，在腫瘤的靶向研究中顯示了其強大的作用，RNA干擾技術(shù)能特異地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而下調(diào)相應蛋白表達[3]。本研究利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建了能高效抑制OPN的慢病毒載體，侵染SW480細胞，細胞內(nèi)OPN表達水平下降，并抑制SW480細胞增殖，為預防或治療腫瘤的藥物研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coliDH5α、pSicoR GFP載體、HEK-293細胞和SW480細胞(本實驗室保存)。 pCMV-VSV-G和pCMV-dR8．91質(zhì)粒(復旦大學醫(yī)學院生化與分子生物學教研室惠贈)。質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(天根生化科技有限公司)；HpaⅠ、XhoⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶(Takara公司)；T4 DNA連接酶和轉(zhuǎn)染試劑(北京全式金公司)； OPN抗體、β-actin抗體和抗鼠熒光二抗(Santa Cruz公司)；OPNsiRNA序列由上海吉瑪公司合成；DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 OPN-siRNA核苷酸的設計與合成： 設計針對OPN蛋白沉默位點的siRNA片段，同時設計Control siRNA序列，該序列為人類基因組中不存在的任何同源性的序列，莖環(huán)序列為5′-TTCAAGAGA-3′。人工合成一對寡核苷酸鏈，含有OPN-siRNA序列及其反向互補序列，并在上游5′端加入HpaⅠ酶切位點、在下游3′端加入XhoⅠ酶切位點，序列見(表1)。

1.2.2 OPN siRNA表達載體的構(gòu)建與鑒定：取稀釋好的正義鏈和反義鏈oligo溶液各5 μL加入0.5 mL小離心管中，再加入5 μL的10×Oligo退火緩沖液，35 μL的DNase/RNase-Free水，共50 μL；放入95 ℃水浴，5 min；反應結(jié)束后，室溫放置30 min；4 ℃保存。退火后的短雙鏈DNA兩端帶有HpaⅠ和XhoⅠ酶切位點(圖1)，將其插入pSicoR質(zhì)粒中，按照1∶10的比例連接，反應條件為16 ℃，1 h；轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中， 37 ℃ Amp抗性培養(yǎng)板上培養(yǎng)12 h；挑取單菌落，搖菌，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定并測序。取測序正確后的克隆，搖菌擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，用于后期的病毒包裝。

表1 OPN-siRNA和control-siRNA序列Table 1 Suences of OPN-siRNA and control-siRNA

x.specific-sequence of siRNA-OPN molecule；y.specific-sequence of siRNA-OPN molecule of inverted complementary圖1 退火后發(fā)夾狀的siRNAFig 1 Annealed hairpin siRNA template insert

1.2.3 重組慢病毒OPN-siRNA的包裝：用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293細胞，37 ℃、5% CO2及100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇細胞匯合至70%～80%的處于增殖旺盛期的293細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前兩個小時，將舊培養(yǎng)液倒掉，換成完全培養(yǎng)基。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒與pCMV-VSV-G和pCMV - dR8．91兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK-293細胞中，4～6 h換新鮮培養(yǎng)基，24和48 h在熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染的效果，并收集病毒上清及細胞。應用TCID50法[公式：病毒滴度=10(X+0.8)(pfu/mL)，x表示：從10-1到10-11依次稀釋度下細胞病毒(cytopathic effect，CPE)陽性率孔數(shù)，單個孔陽性記為0.1。]計算病毒滴度。

1.2.4 Real-time PCR，Western blot 法檢測慢病毒在SW480細胞中的抑制作用：用獲得的兩組病毒分別侵染SW480細胞，與感染后48 h收集細胞，并設計未處理的SW480細胞作為空白對照組，提取各組總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用特異性擴增OPN的引物(上游：GTGATAGCTTGGCTTATGG；下游：CTTTCCGTTGTTGTCCTG，188 bp)，以β-actin(上游：CACTGTGCCCATCTACGA；下游：TGATGTCAC GCACGATTT，155 bp)作為內(nèi)參進行Real-time PCR(PCR擴增參數(shù)：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，95 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)；65 ℃ 5 s，95 ℃)，檢測得到的數(shù)據(jù)根據(jù)2-△△Ct方法分析各組SW480細胞中OPN的mRNA表達水平。同時提取各組細胞的蛋白質(zhì)，等量上樣，SDS-PAGE電泳分離，半干轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉3 h后，加入一抗(OPN：1∶800；β-actin：1∶1 000)，室溫50r/min，過夜， TBST洗4次；加入二抗(山羊抗兔IgG:1∶5 000)，室溫50r/min，4 h， TBST洗后，ECL發(fā)光檢測。實驗重復3次。

1.2.5 MTT法檢測慢病毒對SW480細胞增殖的影響：將SW480細胞鋪于96孔板中，每孔100 μL，細胞密度為5 000～10 000個細胞/孔。次日更換無血清培養(yǎng)液，加入重組病毒，5% CO2，37 ℃孵育，分別于12、24、48和72 h后終止刺激。更換無血清培養(yǎng)液，每孔90 μL，加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，溶解結(jié)晶。檢測490 nm的吸光度(A490)值。試驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

重組質(zhì)粒pSicoR-Control-siRNA和pSicoR-OPN-siRNA通過XhoⅠ和XbaⅠ酶切后得到的大片段約為7.3 kb，小片段分別為389 bp和393 bp，空pSicoR質(zhì)粒小片段約為334 bp(圖2)，且測序結(jié)果與所設計的siRNA-OPN序列完全一致(圖3)。

1.2 000 bp DNA marker; 2.the bland pSicoR group; 3.OPN-siRNA; 4.control siRNA圖2 重組質(zhì)粒酶切驗證Fig 2 Enzymatic digestion of the recombinant plasmid

圖3 插入DNA片段測序圖Fig 3 Sequence of the inserts

2.2 重組慢病毒顆粒的制備及滴度的測定

成功包裝慢病毒(圖4)；并測得病毒滴度：OPN與Control病毒的有效滴度分別為1×106pfu/mL和1×105pfu/mL。

(A/a)OPN lentivirus vector；(B/b)control lentivirus vector圖4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞Fig 4 Recombinant plasmid was transfected in HEK293 cells

2.3 慢病毒侵染SW480細胞mRNA與蛋白檢測

OPN-siRNA病毒侵染后，SW480細胞mRNA(圖5A)及蛋白(圖5B)的表達較未侵染組與control-siRNA組明顯降低，未侵染組較control-siRNA組無明顯差異。

A.OPN mRNA expression in SW480 cells;*Plt;0.05 compared with control group and the blank group；B.OPN protein expression in SW480 cells圖5 SW480細胞OPN mRNA與蛋白水平檢測Fig 5 OPN mRNA and protein expression level of SW480 cells

2.4 慢病毒對SW480細胞增殖的影響

OPN-siRNA病毒侵染12 h后，SW480細胞較未侵染組與control-siRNA組的細胞增殖活性明顯降低(Plt;0.05)；而control-siRNA組與未侵染組的細胞增殖活性無明顯改變(圖6)。

*Plt;0.05 compared with control group and the blank group圖6 LV-siRNA-OPN 對SW480細胞增殖的影響Fig 6 LV-siRNA-OPN influenced the inhibition rate of SW480 cells

3 討論

OPN是一種相對分子質(zhì)量約44 kd的分泌型磷酸化糖蛋白，含有314個氨基酸殘基[4]。OPN廣泛分布于人體各種器官及組織，并與不同的受體結(jié)合，發(fā)揮不同的生物學功能，研究表明，OPN通過與整合素受體相結(jié)合，促進細胞的黏附和遷移， OPN還可以與CD44受體相結(jié)合，介導腫瘤細胞的進展和侵襲。OPN也可能通過上調(diào)其他基因表達來促進癌癥的生長與轉(zhuǎn)移，早期研究已將整合素蛋白和CD44視為治療腫瘤的靶分子。阻斷OPN與其受體結(jié)合，在體外實驗中可以降低腫瘤的黏附、侵襲和侵潤；在體內(nèi)實驗中可以降低腫瘤的進展和轉(zhuǎn)移[5]；抑制結(jié)直腸腫瘤的小鼠OPN的表達，可以提高小鼠的生存率[6]。因此，抑制OPN的表達有望成為新的治療腫瘤的靶點來治療對其具有依賴性的腫瘤。

RNA干擾是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制，小分子雙鏈mRNA能夠特異性地降解與之互補靶基因的mRNA，沉默目的基因的表達，為基因功能的研究提供了一個重要的方法[7]。本研究利用RNA干擾技術(shù)，合成針對OPN的特異性的基因序列，克隆到慢病毒載體上，并成功包裝重組慢病毒，將其作用于SW480細胞，發(fā)現(xiàn)所包裝的病毒可有效地抑制OPN的表達，同時病毒能夠抑制SW480細胞的增殖，與以往研究結(jié)果相符[8]。迄今為止，慢病毒已應用于多種惡性腫瘤的基礎研究中，包括骨肉瘤、白血病、肝癌及鼻咽癌等，主要通過慢病毒將腫瘤的治療基因安全地轉(zhuǎn)移到靶細胞及組織內(nèi)，來抑制腫瘤的生長，遷移和侵襲。將OPN RNA干擾技術(shù)與慢病毒載體相結(jié)合，并將成功包裝的重組慢病毒直接導入瘤體部位，使其抑制作用更持久，擴大了載體感染細胞的范圍，使其在細胞及組織內(nèi)持續(xù)、高效的抑制OPN分子，降低其表達水平，并減少OPN與受體結(jié)合，從而達到治療結(jié)腸癌的目的，為今后結(jié)腸癌的具體治療研究提供了實驗基礎。

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Construction of osteopontin siRNA expression lentivirus vector and its inhibitory effect on the proliferation of SW480 cells

XING Yi-wen1，BAI Jing1，F(xiàn)AN Wei-ning1，LIU Xin1，ZHOU Lin-lin1，XU Guang-xian1,2*

(1.Institute of Laboratory Medicine; 2.Medical Experimental Center, General Hospital,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)

ObjectiveTo construct a recombinant lentivirus vector and explore its effects on colon cancer cell line SW480.MethodsThe siRNA interfering sequence targeting to osteopontin gene was designed and synthesized,then DNA segment was gained through annealing after chemosynthesis,and then was cloned to pSicoR vector, the recombinant lentivirus vector was constructed and used to challenge SW480 cells.The expression level of osteopontin mRNA and protein was detected by real time PCR and Western blot. The effects on SW480 cells proliferation were analyzed by MTT assay.ResultsThe restriction enzyme digestion,DNA sequencing and detection of GFP expression demonstrated that recombinant lentivirus vector was successfully constructed. Real time PCR and Western blot analysis confirmed that the expression of OPN mRNA and protein were inhibited.The MTT assay showed that the anti-proliferation effect of lentivirus vector of osteopontin-siRNA on SW480 cells were significant(Plt;0.05).ConclusionsThe recombinant lentivirus vector could effectively inhibit the expression of osteopontin in SW480 cells and depress the proliferation of SW480 cells.

osteopontin; siRNA; lentivirus; SW480 cell

2013-06-26

2013-10-29

寧夏高等學?？茖W技術(shù)研究項目(2011)

*通信作者(correspondingauthor)： xuguangxianlab@aliyun.com

1001-6325(2014)03-0350-05

研究論文

R735

A