劉鳳霞，牛淑亮，李建勇，鄭樹濤，盧曉梅，劉文亞

(新疆醫(yī)科大學 1.基礎(chǔ)醫(yī)學院 人體解剖學教研室； 2.第一附屬醫(yī)院 醫(yī)學研究中心；3.第一附屬醫(yī)院 影像中心， 新疆 烏魯木齊 830011)

ERK1/2 MAPK通路在Eca109細胞體外增殖和遷移中的作用及其機制

劉鳳霞1，牛淑亮1，李建勇1，鄭樹濤2，盧曉梅2，劉文亞3*

(新疆醫(yī)科大學 1.基礎(chǔ)醫(yī)學院 人體解剖學教研室； 2.第一附屬醫(yī)院 醫(yī)學研究中心；3.第一附屬醫(yī)院 影像中心， 新疆 烏魯木齊 830011)

目的觀察ERK1/2 MAPK通路在食管鱗狀細胞癌(ESCC)Eca109細胞系增殖和遷移中的作用并探討其作用機制。方法使用MAPK(ERK1/2)抑制劑U0126處理Eca109細胞；細胞計數(shù)檢測細胞增殖；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測ERK1/2 mRNA；Western blot檢測總ERK1/2(t-ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)；MTT和細胞劃痕實驗檢測細胞增殖和遷移能力；qRT-PCR檢測MicroRNA-21(miR-21)。結(jié)果20 μmol/L濃度的U0126可抑制Eca109細胞生長(Plt;0.05)，破壞細胞正常形態(tài)，ERK1/2 MAPK通路的活化在蛋白質(zhì)水平被抑制(Plt;0.05)，Eca109細胞增殖和遷移明顯減弱(Plt;0.05)，顯著下調(diào)miR-21的表達(Plt;0.05)。結(jié)論ERK1/2 MAPK信號通路抑制可減弱Eca109細胞增殖和遷移，其可能的作用機制之一與其抑制miR-21表達有關(guān)。

ERK1/2；Eca109細胞；增殖；遷移；MicroRNA-21

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中其發(fā)病率位居第9位，死亡率居第6位[1]，其中食管鱗癌占食管癌的90%以上。目前的治療以手術(shù)切除治療為主，結(jié)合放化療綜合進行，雖然這些方法對某些早期發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤可起到根治性作用，但多數(shù)食管癌患者確診時已處于晚期階段，對這些患者僅僅起到姑息性治療作用，5年生存率僅為10%左右[2]，中位生存時間僅8～13個月[3]，患者最終死于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase, ERK)相關(guān)的細胞內(nèi)信號傳導途徑被認為是經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號傳導途徑。ERK1/2正常定位于胞質(zhì)內(nèi)，當激活后進入細胞核，ERK肽鏈的183位蘇氨酸和185位酪氨酸均發(fā)生磷酸化為該激酶活化所必須[4]。活化的ERK1/2信號傳導途徑作用于多種轉(zhuǎn)錄因子及核蛋白，促進某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達，參與腫瘤細胞增殖、分化、遷移、侵襲和凋亡等多種生物學效應(yīng)，ERK1/2的過度表達在細胞惡性轉(zhuǎn)化及演進中起著重要的作用。因此研究ERK1/2 MAPK通路在食管鱗癌Eca109細胞體外增殖和遷移中的作用及其作用機制，有望為食管鱗癌的早期診斷、早期防預(yù)、早期治療提供線索并且希望為聯(lián)合治療注入新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

食管鱗癌細胞系Eca109 (中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)，胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，U0126(Promega公司)，用234 μL二甲基亞砜(DMSO)重懸1 mg U0126，即可得到濃度為10 mmol/L的儲存液，無抗無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋U0126儲存液成所需濃度工作液，順鉑(齊魯藥業(yè)有限公司)，Trizol、WesternBreeze 免疫檢測試劑盒(Invitrogen公司)，DMSO、methylthiazolyl blue tetrazolium(MTT)(Sigma公司)，PrimeScriptTMone step RT-PCR kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix(大連寶生物公司)， RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(博邁德公司)，ERK1/2抗體(Celling Signaling Technology 公司)， β-tubulin抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，RT-PCR引物由TaKaRa公司設(shè)計并合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence for qRT-PCR

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和U0126干預(yù): Eca109細胞分為4個組，分別是對照組(NC)、DMSO組、U0126組和抗腫瘤藥物順鉑組(DDP)。5×105個/孔接種6孔板，含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，正常培養(yǎng)24 h達到80%匯合，用磷酸緩沖液(PBS)洗去懸浮細胞，20 μmol/L濃度的MAPK(ERK1/2)抑制劑U0126干預(yù)Eca109細胞。

1.2.2 細胞計數(shù)：在顯微鏡下用10×物鏡觀察計數(shù)四角大分格中的細胞數(shù)， 細胞數(shù)/mL=(4大格細胞數(shù)之和/4)×104×稀釋倍數(shù)，每組設(shè)6個復孔。

1.2.3 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài):倒置顯微鏡下放大200倍觀察各組細胞0、24、48和72 h細胞形態(tài)學變化并采集圖像，每組設(shè)6個復孔。

1.2.4 qRT-PCR擴增:Trizol方法抽提細胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，模板2 μL(2 μg)，β-actin、ERK1/2的上、下游引物(表1)各0.5 μL(10 pmol)，SYBR 10 μL、 ddH2O 7 μL，擴增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，57.8 ℃退火30 s，40個循環(huán)。分別以miR-21和U6反轉(zhuǎn)錄引物行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，miR-21和U6的特異性引物(表1)進行qRT-PCR，反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)，每組設(shè)6個復孔。

1.2.5 Western blot：1×106個細胞加入RIPA裂解液80 μL，12 000r/min離心5 min，收集上清，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。取50 μg蛋白質(zhì)于10%十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠中，25 mA/膠恒定電流電泳至分離膠底端；80 V恒定電壓、常溫、100 min轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉1 h。加入β-tubulin、t-ERK1/2、p-ERK抗體(1∶1 000稀釋于一抗稀釋液中)于4 ℃過夜。加入通用性二抗，室溫反應(yīng)2 h，顯色試劑作用直至條帶出現(xiàn)，ddH2O終止顯色反應(yīng)。信號條帶利用Quantity one軟件進行灰度掃描，每組實驗重復6次。

1.2.6 MTT檢測細胞增殖：5×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，標準條件下培養(yǎng)過夜，更換培養(yǎng)液。分別于U0126處理后0、24、48、72和96 h加入5 g/L MTT，20 μL/孔, 37 ℃培養(yǎng)4 h。去上清加入150 μL DMSO, 37 ℃避光搖動10 min，ELISA讀板機(490 nm)測定吸光度，每組均設(shè)置6個復孔。

1.2.7 細胞劃痕實驗：用無菌槍頭對孔內(nèi)細胞做劃痕，PBS沖洗細胞，正常培養(yǎng)。0、24、48和72 h通過倒置顯微鏡觀察細胞劃痕并采集圖像，用刻度尺測量劃痕寬度，評估傷口愈合程度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度U0126對Eca109細胞增殖的影響

U0126對Eca109細胞增殖的抑制具有濃度依賴性，20 μmol/L濃度的U0126可明顯抑制細胞增殖，并且抑制效果溫和(Plt;0.05)(圖1)，能夠達到研究的要求，故后續(xù)研究都采用20 μmol/L濃度的U0126干預(yù)細胞。

*Plt;0.05 compared with NC group圖1 不同濃度U0126對Eca109細胞增殖的影響Fig 1 The effect of different concentration of U0126 on the proliferation of Eca109 cell line

2.2 U0126對Eca109細胞形態(tài)的影響

20 μmol/L濃度的U0126顯著改變Eca109細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。與NC和DMSO組相比，U0126組細胞變得比較小，呈梭狀或疊瓦樣，多邊形，輪廓不清，胞膜多棱角，核及核仁不清，胞質(zhì)內(nèi)粗糙，可見多量粉塵樣細胞器堆積物，細胞易老化，匯合后排列不夠緊密，鋪路石樣外觀不典型，相互接壤處模糊，上皮膜邊緣不整齊(圖2)。

A.NC group；B.DMSO group；C.U0126 group；D.DDP group圖2 U0126干預(yù)后Eca109細胞形態(tài)Fig 2 Cell morphology in Eca109 cell line after dealed with U0126(×200)

2.3U0126對Eca109細胞中ERK1/2MAPK通路的影響

Eca109細胞經(jīng)濃度為20 μmol/L的U0126處理48和72 h后，與NC組和DMSO組相比，U0126組和DDP組中ERK1/2 mRNA表達無明顯變化(圖3)，U0126組和DDP組中t-ERK1/2蛋白表達無變化，而U0126組中p-ERK1/2表達明顯抑制 (Plt;0.05)(圖4)。

圖3 U0126對ERK1/2 mRNA表達的影響Fig 3 The effect of U0126 on ERK1/2 mRNA

*Plt;0.05 compared with NC and DMSO group圖4 U0126干預(yù)后Eca109細胞中ERK1/2蛋白表達Fig 4 The effect of U0126 on ERK1/2 protein expression in Eca109 cell line

2.4ERK1/2MAPK通路對Eca109細胞增殖的影響

食管癌Eca109細胞經(jīng)濃度為20 μmol/L的U0126處理0、24、48、72和96 h后，與NC和DMSO組相比，U0126和DDP組中細胞增殖明顯被抑制(Plt;0.05)，與抗腫瘤藥物DDP組相比，U0126組細胞增殖變化差異不顯著(圖5)。

*Plt;0.05 compared with NC and DMSO group圖5 U0126干預(yù)后Eca109細胞增殖Fig 5 The porliferation of Eca109 cell after dealed with U0126

2.5ERK1/2MAPK通路對Eca109細胞遷移的影響

食管癌Eca109細胞經(jīng)濃度為20 μmol/L的U0126處理0、24、48 和72 h后, 與NC和DMSO組相比，U0126和DDP組中細胞遷移明顯被抑制(Plt;0.05)，與抗腫瘤藥物DDP組相比，U0126組細胞增殖變化差異不顯著(圖6)。

*Plt;0.05 compared with NC and DMSO group圖6 細胞劃痕實驗檢測U0126干預(yù)后Eca109細胞遷移Fig 6 Wound scratch assay detected the migration of Eca109 cell after dealed with U0126

2.6ERK1/2MAPK通路對Eca109細胞中miR-21表達的影響

食管癌Eca109細胞經(jīng)濃度為20 μmol/L的U0126處理48 h后, 與NC組和DMSO組相比，U0126組中miR-21表達明顯下調(diào)(Plt;0.05)(圖7)。

3 討論

ERK1/2 MAPK通路阻斷可抑制胃癌、乳腺癌等細胞凋亡、促進細胞侵襲，并且抑制miR-21及其靶基因表達[5-7]。MiR-21是microRNA家族中的一個亞型，在大多數(shù)惡性腫瘤中，如胃癌[8]、結(jié)直腸癌[9]、胰腺癌[10]等細胞或組織中，miR-21的表達均顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)20 μmol/L濃度的U0126在蛋白質(zhì)水平明顯阻斷Eca109細胞中ERK1/2 MAPK通路活化，并且使其失去正常細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。ERK1/2 MAPK通路活化被阻斷后，Eca109細胞增殖和遷移明顯被抑制，細胞中miR-21表達顯著下調(diào)，這些結(jié)果表明ERK1/2 MAPK通路阻斷可抑制Eca109細胞增殖和遷移，其可能的機制之一是ERK1/2 MAPK信號通路正調(diào)控具有癌基因作用的miR-21表達。本研究進一步揭示ERK1/2在食管鱗癌中發(fā)揮癌基因的作用，為解決食管鱗癌癌增殖和遷移問題提供一定的理論依據(jù)，也將會為臨床上食管鱗癌的治療及預(yù)后判斷提供新的思路和方法。

*Plt;0.05 compared with NC and DMSO group圖7 U0126干預(yù)后Eca109細胞中miR-21表達下調(diào)Fig 7 U0126 downregulated the miR-21 expresson in Eca109 cell line(±s,n=6)

[1] Parkin DM, Bray F, Ferlay J,etal. Estimating the world cancer burden:Globocan 2000 [J]. Int J Cancer, 2001, 94:153-156.

[2] Ekman S, Dreilich M, Lennartsson J,etal. Esopha-geal cancer: current and emerging therapy modalities [J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2008,8:1433-48.

[3] González Ortiz DI, Toro DH. Esophageal cancer subtypes and survival rates at the VA Caribbean Healthcare System: a 10-year experience[J]. Bol Asoc Med P R, 2009,101:14-17.

[4] Whitmarsh AJ,Davis RJ.Transcription factor AP-1 regulation bymitogen-activated protien kinase signal transduction pathway[J]. Mol Med,1996,74: 589-607.

[5] Lim SC, Duong HQ, Parajuli KR,etal. Pro-apoptotic role of the MEK/ERK pathway in ursode-oxycholic acid-induced apoptosis in SNU601 gastric cancer cells[J]. Oncol Rep, 2012, 28: 1429-34.

[6] Ling M, Li Y, Xu Y,etal. Regulation of miRNA-21 by reactive oxygen species-activated ERK/NF-κB in arsenite-induced cell transformation[J]. Free Radic Biol Med, 2012, 52: 1508-1518.

[7] Huang TH, Wu F, Loeb GB,etal. Up-regulation of miR-21 by HER2/neu signaling promotes cell invasion[J]. J Biol Chem, 2009,284: 18515-18524.

[8] Yamanaka S, Olaru AV, An F,etal. MicroRNA-21 inhibits Serpini1, a gene with novel tumour suppressive effects in gastric cancer[J]. Dig Liver Dis, 2012，44:589-596.

[9] Faltejskova P, Besse A, Sevcikova S,etal. Clinical correlations of miR-21 expression in colorectal cancer patients and effects of its inhibition on DLD1 colon cancer cells[J]. Int J Colorectal Dis, 2012, 27: 1401-1408.

[10] Moriyama T, Ohuchida K, Mizumoto K,etal. MicroRNA-21 modulates biological functions of pancreatic cancer cells including their proliferation, invasion, and chemoresistance[J]. Mol Cancer Ther, 2009, 8:1067-1074.

The role and mechanism of ERK1/2 MPAK
pathway in proliferation and migration of Eca109 cell lineinvitro

LIU Feng-xia1, NIU Shu-liang1, LI Jian-yong1, ZHENG Shu-tao2, LU Xiao-mei2, LIU Wen-ya3*

(1.Dept. of Anatomy, College of Basic Medicine；2.Medical Research Center, the First Affiliated Hospital；3.Dept. of Radiology，the First Affiliated Hospital，Xinjiang Medical University, Urumqi 830011，China)

ObjectiveTo investigate the role and mechanism of ERK1/2 MPAK pathway in regulating proliferation and migration of Eca109 cell lineinvitro.MethodsWe treated Eca109 cells with MAPK(ERK1/2)inhibitor(U0126); cell counting method detected the cell proliferation; Cell morphology was observed under inverted microscope；qRT-PCR detectedERK1/2 mRNA level; Western blot determined the expression of ERK1/2 protein level; MTT and Wound scratch assay detected cell proliferation and migration; qRT-PCR examined miR-21 expression.ResultsCell growth was inhibited by U0126 at 20 μmol/L doses(Plt;0.05), destroyed the normal cell morphology; inactivited ERK1/2 MPAK pathway at protein level(Plt;0.05); inhibition of ERK1/2 MPAK pathway repressed cell proliferation and migration of Eca109 cells and downregulated the expression ofmiR-21(Plt;0.05).ConclusionsInhibition of ERK1/2 MPAK pathway inhibits proliferation and migration of Eca109 cells, one of the most possible mechanism is associated it’s effect onmiR-21 expression.

ERK1/2; Eca109 cell; proliferation; migration; MicroRNA-21

2013-06-15

2013-10-09

新疆自治區(qū)科技廳面上項目(2012211A080)

*通信作者(correspondingauthor)： wenyaliu2002@163.com.cn

1001-6325(2014)03-0345-05

研究論文

R 735.1

A