吳小婷， 張 怡， 吳清吟， 汪 穎， 鄭寶東

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002)

抗性淀粉(resistant starch，RS)是一類在健康者小腸中無法被吸收利用的淀粉［1-2］，但可在結(jié)腸中被大腸菌群發(fā)酵或部分發(fā)酵，具有類似可溶性膳食纖維的生理功能，包括預(yù)防胃腸疾病和心血管疾病;降低潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn);促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)和礦質(zhì)元素的吸收，增強(qiáng)疾病抵抗力等［3］.抗性淀粉由于能通過降低血糖指數(shù)來減少血漿胰島素和血糖反應(yīng)，且具有飽腹感，而被視為控制體重的良好選擇.它除擁有未改性淀粉所不具有的生理功能外，具有更好的食用口感.把抗性淀粉添加于食品中，能使食品呈現(xiàn)特殊質(zhì)地，甚至延長(zhǎng)食品貨架期［4-5］.近年來，人們對(duì)健康的關(guān)注，使得對(duì)功能性保健食品的要求日趨提高，抗性淀粉也成為人們新的研究對(duì)象［6］.根據(jù)抗性原理的不同，抗性淀粉可分為5類［7］:即 RS1物理包埋淀粉，其蛋白質(zhì)與細(xì)胞壁的包埋作用是引起抗性的主要原因;RS2抗性淀粉顆粒，包括具有抗性的天然淀粉顆粒和未糊化的淀粉顆粒;RS3回生或結(jié)晶淀粉;RS4化學(xué)改性淀粉，交聯(lián)淀粉是其中常見的一種;RS5直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合淀粉，亦稱淀粉脂.RS3是淀粉糊經(jīng)過糊化后，其中的直鏈淀粉經(jīng)過低溫冷卻，結(jié)晶形成的難以被淀粉酶酶解的老化淀粉［8］.雖然RS3與RS4都可以通過加工原淀粉大量制備，但RS4的制備過程中添加的化學(xué)試劑將會(huì)影響食品安全.由于RS3具有營(yíng)養(yǎng)特性、加工穩(wěn)定性及食用安全性，其應(yīng)用前景良好，成為近幾年研究的熱點(diǎn)［9］.制備RS3方法多樣:熱液法，物理擠壓法，化學(xué)酶解法.微波［10］、超高壓［11］以及超聲波［12-13］亦被應(yīng)用于RS3制備中.

蓮子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，并含有特殊的藥理成分［14-16］，屬于藥食同源的食物［17］.蓮子中的直鏈淀粉與抗性淀粉的形成有關(guān).壓熱法制備抗性淀粉是通過高溫、高壓使淀粉顆粒膨脹破裂，糊化形成淀粉凝膠.在此過程中，無規(guī)則狀態(tài)的直鏈淀粉(random coil)從顆粒中溶出.在冷卻回生過程中，直鏈淀粉遷移，游離的直鏈淀粉鏈通過氫鍵重新結(jié)合形成雙螺旋結(jié)構(gòu)(junction zones)，之后進(jìn)一步折疊盤繞形成結(jié)晶(crystallites)，產(chǎn)生抗性.此過程淀粉分子經(jīng)歷了從雜亂無章狀態(tài)到緊湊有序的結(jié)晶結(jié)構(gòu)［18］.研究表明，隨著直鏈淀粉含量的提高，其淀粉糊在低溫環(huán)境下越容易老化形成抗性淀粉［19］，這為蓮子抗性淀粉的制備提供了可靠的理論依據(jù).超聲波是一種振動(dòng)頻率高于人耳接收范圍的機(jī)械波［20］.這種聲波在溶液中傳播時(shí)，能夠加速溶劑分子與溶質(zhì)分子之間的摩擦，切斷聚合物分子連接鍵形成長(zhǎng)度較短的分子鏈.其振動(dòng)的能量在傳播過程中會(huì)被聚合物吸收，從而使分子所含的能量提高，這對(duì)直鏈淀粉的重結(jié)晶具有積極作用［21-22］.將超聲波運(yùn)用于壓熱法制備抗性淀粉的研究未見報(bào)道.

本文通過濕磨法獲得蓮子原淀粉，運(yùn)用超聲波對(duì)原淀粉進(jìn)行預(yù)處理，并結(jié)合壓熱法制得抗性淀粉.研究的單因素為:淀粉乳濃度、超聲波功率、超聲波處理時(shí)間、壓熱時(shí)間和壓熱溫度.運(yùn)用正交獲得最優(yōu)工藝參數(shù)，為促進(jìn)蓮子淀粉商品化生產(chǎn)提供參考［23］.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮凍蓮，綠田(福建)食品有限公司，產(chǎn)自福建建寧;葡萄糖淀粉酶(100000 U/mL)，阿拉丁試劑公司;α-淀粉酶(10000 U/mL)，美國(guó) ANKOM 科技公司;檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙酸、氫氧化鉀、3，5-二硝基水楊酸、苯酚，分析純，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

KQ2200DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;MJ-60BM01A型美的榨汁機(jī)，廣東美的生活電器制造有限公司;101-0ES型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，濟(jì)南金光儀器設(shè)備制造有限公司;DZQ400/2D型單室真空包裝機(jī)，溫州市新達(dá)包裝機(jī)械有限公司;GI54TW型全自動(dòng)立式高壓滅菌鍋，南京庚辰科學(xué)儀器有限公司;XCD-235H型新飛臥式微凍冷凍箱，河南新飛電器有限公司;Starter 300型便攜式pH計(jì)，美國(guó)奧豪斯(上海)有限公司;THZ-82A型水浴恒溫振蕩器，江蘇榮華儀器制造有限公司;L-530型臺(tái)式大容量低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原淀粉提取

以一定質(zhì)量的新鮮凍蓮隔絕空氣解凍后，加入2倍質(zhì)量的蒸餾水置于榨汁機(jī)中攪碎成蓮子漿，漿液過100目篩紗布，加2倍蒸餾水稀釋攪拌后，20～25℃靜置沉淀8 h.淀粉完全沉降分層后棄去上澄清液，用蒸餾水沖洗沉淀表面，再次用足量的蒸餾水溶解沉淀，在同樣的溫度下靜置，直至淀粉和水完全分層，棄去上清液.最后用蒸餾水清洗沉淀表面，平鋪于托盤中，50℃烘干至淀粉水分含量為11.8%［18］，取出密封保存.

1.3.2 抗性淀粉制備

稱取不同質(zhì)量的蓮子淀粉加入蒸餾水配制成不同濃度的淀粉乳溶液，充分?jǐn)嚢韬笱b入真空包裝袋中抽真空包裝.將淀粉乳超聲波處理后于高壓滅菌鍋中隔層放置.在高壓滅菌鍋的作用下，使淀粉糊化.之后取出淀粉糊冷卻至室溫，在4℃下冷藏12 h，干燥粉碎，過篩后密封儲(chǔ)藏備用.

1.3.3 抗性淀粉得率測(cè)定［24］

未純化的蓮子抗性淀粉中加入3倍體積的蒸餾水，配制成抗性淀粉溶液.往該溶液中加入適量檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，充分?jǐn)嚢?移取足量液體α-淀粉酶(10000 U/mL)于溶液中，在溫度為90℃的恒溫振蕩器中作用至使碘液不變藍(lán)，之后自然冷卻.將4 mol/L的檸檬酸加入至冷卻的溶液中，調(diào)節(jié)pH值4.2左右后再加入過量液體葡萄糖淀粉酶(100000 U/mL)，在溫度為60℃ 的恒溫振蕩器中作用1 h后，自然冷卻.將所得溶液4000 r/min離心12min，緩慢取出離心管，防止抖動(dòng).倒出上清液后，以蒸餾水溶解沉淀.再次離心，重復(fù)上述過程3次.往沉淀中加入5 mL 2 mol/L KOH溶液，用攪拌器持續(xù)攪拌30min，使蓮子抗性淀粉完全溶解.堿性溶液中加入1 mol/L的乙酸溶液使pH為4.2左右，加入過量液體葡萄糖淀粉酶(100000 U/mL)，60℃恒溫振蕩器中作用1 h.之后，溶液在4000 r/min轉(zhuǎn)速下作用10min，收集上層液體，用少量蒸餾水洗滌沉淀.溶解沉淀，再次離心，重復(fù)3次.將所有上清液混合，最后定容至100 mL.DNS法［25］測(cè)定樣品中葡萄糖含量.蓮子抗性淀粉得率計(jì)算如式(1):

式(1)中，W為蓮子淀粉質(zhì)量，g;c'為樣品葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL;V為抗性淀粉溶解液體積，mL;N為抗性淀粉溶解液稀釋倍數(shù).

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

影響蓮子抗性淀粉得率的主要因素有:蓮子淀粉乳濃度、超聲波功率、超聲波處理時(shí)間、壓熱時(shí)間和壓熱溫度.為確定各因素最佳范圍，按表1進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).

表1 單因素水平設(shè)計(jì)Tab.1 Factors and levels of single factors

以淀粉乳濃度為單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定超聲波功率為210 W，超聲波處理時(shí)間為25min，壓熱溫度為105℃，壓熱時(shí)間為9min.以超聲波功率為單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定蓮子淀粉乳濃度為25%，超聲波處理時(shí)間為25min，壓熱溫度為105℃，壓熱時(shí)間為9min.以超聲波處理時(shí)間為單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定淀粉乳濃度為25%，超聲波功率為210 W，壓熱溫度為105℃，壓熱時(shí)間為9min.以壓熱時(shí)間為單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定淀粉乳濃度為25%，超聲波功率為210 W，超聲波處理時(shí)間為25min，壓熱溫度為105℃.以壓熱溫度為單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，固定淀粉乳濃度為25%，超聲波功率為210 W，超聲波處理時(shí)間為25min，壓熱時(shí)間為9min.

1.4.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，淀粉乳濃度、壓熱時(shí)間、壓熱溫度對(duì)得率影響較大.超聲波作為前處理，其作用時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響制備的效率.故以以上4個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化，設(shè)計(jì)方案見表2.

表2 正交試驗(yàn)L9(34)因素水平與編碼Tab.2 Factors levels and codes in orthogonal test L9(34)

1.4.3 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)平行做3次;以平均值表示試驗(yàn)結(jié)果;運(yùn)用Excel 2013和DPSv 7.05數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由吸光度對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，求得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線Y=0.4780X+0.0044，相關(guān)系數(shù) R2=0.9999，如圖1.

圖1中，Y為在480 nm波長(zhǎng)處測(cè)定的吸光度值;X為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度(mg/mL).

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2.

由圖2(a)可知，在淀粉乳濃度低于45%條件下，蓮子抗性淀粉的得率隨著淀粉乳濃度的提高而增加.在淀粉濃度達(dá)到45%時(shí)，此時(shí)得率達(dá)最高.在淀粉乳濃度高于45%條件下，蓮子抗性淀粉的得率卻隨著淀粉乳濃度的升高而減少.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:淀粉乳濃度的不同影響著抗性淀粉含量的高低.蓮子原淀粉晶體是由直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成的，經(jīng)過超聲波預(yù)處理后，原淀粉顆粒破裂，直鏈淀粉被切割成長(zhǎng)度較短的分子鏈并部分溶出.在糊化時(shí)，支鏈淀粉結(jié)構(gòu)瓦解，直鏈淀粉從顆粒中溢出.當(dāng)?shù)矸廴闈舛冗m宜時(shí)，溶出的直鏈淀粉能較充分地結(jié)合，促進(jìn)回生，有利抗性淀粉形成.當(dāng)?shù)矸廴槿芤簼舛冗^高時(shí)，體系中的水不足以使淀粉顆粒完全膨脹，直鏈淀粉無法完全從顆粒中釋放出來，體系黏度變大，進(jìn)而限制其相互接近形成重結(jié)晶，降低了抗性淀粉的得率;當(dāng)?shù)矸廴槿芤簼舛冗^低，雖然充足的水分能使直鏈淀粉完全溢出，但是直鏈淀粉分子在低溫回生過程中，相互接近形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的概率降低，導(dǎo)致抗性淀粉得率下降［11］.因此，適宜的淀粉乳濃度有利于抗性淀粉的形成.

圖2 淀粉乳濃度、超聲波功率、超聲波處理時(shí)間、壓熱時(shí)間以及壓熱溫度對(duì)蓮子抗性淀粉得率的影響Fig.2 Effects of starch concentration，ultrasonic power，ultrasonic time，autoclaving time，and autoclaving temperature on yield of lotus seed resistant starch

由圖2(b)可知，蓮子抗性淀粉得率隨著超聲波功率的增大而提高.在超聲波清洗器滿功率300 W時(shí)蓮子抗性淀粉得率達(dá)到最高.這是因?yàn)楦邚?qiáng)度超聲波能破壞淀粉顆粒.蓮子淀粉乳在超聲波的作用下，水分子與淀粉分子之間摩擦加快，從而引起淀粉分子C—C鍵斷裂［26］，生成大量較短的C—C分子鏈.較短的C—C分子鏈更有利于通過氫鍵形成雙螺旋結(jié)構(gòu)［27］.因此，適當(dāng)強(qiáng)度的超聲作用可提高抗性淀粉得率.

由圖2(c)可知，蓮子抗性淀粉得率隨超聲波處理時(shí)間的增加其差異并不顯著.超聲波功率和超聲波處理時(shí)間共同影響著淀粉的水解程度，但從圖2(b)和圖2(c)的曲線變化來看，超聲波處理時(shí)間對(duì)蓮子抗性淀粉得率的影響小于超聲波功率.在抗性淀粉的制備過程中，適宜的超聲波處理有助于縮短抗性淀粉的制備時(shí)間［28］.

由圖2(d)可知，隨著壓熱時(shí)間的延長(zhǎng)，蓮子抗性淀粉得率先增大后變小，最后趨于平穩(wěn).在壓熱時(shí)間為9min時(shí)蓮子抗性淀粉得率達(dá)到最高.壓熱時(shí)間為9，12，15min對(duì)抗性淀粉得率并無顯著差異影響.短時(shí)間的壓熱處理不利于抗性淀粉的形成，然而過長(zhǎng)時(shí)間的壓熱處理并沒有顯著提高蓮子抗性淀粉的得率.相關(guān)研究顯示，壓熱時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)抗性淀粉的形成有一定影響.在超聲波預(yù)處理作用下，雖然淀粉顆粒中部分直鏈淀粉溢出，但支鏈淀粉中的α-1，6-糖苷鍵的存在會(huì)阻礙直鏈淀粉相互接近.經(jīng)過壓熱處理過程，支鏈淀粉溶解膨脹，直鏈淀粉將完全溶出.但當(dāng)壓熱時(shí)間過短，將導(dǎo)致支鏈淀粉無法完全糊化，直鏈淀粉的溢出受到抑制且此時(shí)其聚合度較高，分子間斥力較大，分子鏈之間不容易聚集形成晶體.然而，壓熱時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致直鏈淀粉過度降解，使其長(zhǎng)度偏短，分子量偏小.這種被過度降解的淀粉分子，長(zhǎng)度偏短、分子量偏小，因而無法通過氫鍵的作用形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而影響抗性淀粉的形成.可見蓮子淀粉的壓熱時(shí)間以9min為宜.

由圖2(e)可知，蓮子抗性淀粉得率在壓熱溫度為105℃時(shí)達(dá)到最高，且相對(duì)于其他壓熱溫度影響顯著.當(dāng)壓熱溫度處于85～95℃時(shí)，只有部分直鏈淀粉溢出，淀粉只發(fā)生部分糊化;當(dāng)壓熱溫度達(dá)95℃以上時(shí)，大量的直鏈淀粉分子從淀粉顆粒中溢出，支鏈淀粉完全糊化，此時(shí)溶液呈凝膠狀態(tài).當(dāng)溫度進(jìn)一步升高至105℃時(shí)，此時(shí)體系的黏度要比淀粉剛糊化的時(shí)候低，這對(duì)直鏈結(jié)合形成穩(wěn)定結(jié)晶結(jié)構(gòu)有幫助.而當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，直鏈淀粉過度降解，難以形成直鏈淀粉集聚區(qū).此時(shí)晶核無法結(jié)合直鏈淀粉，晶體的進(jìn)一步增長(zhǎng)受到限制，不利于抗性淀粉的形成［29］.

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果:抗性淀粉得率在超聲波低功率時(shí)均處于較低水平，當(dāng)超聲波功率達(dá)到儀器最高值300 W時(shí)，蓮子抗性淀粉得率最高.故正交試驗(yàn)時(shí)選取淀粉乳濃度(%)、超聲波處理時(shí)間(min)、壓熱時(shí)間(min)和壓熱溫度(℃)為考察因素，采用L9(34)正交表，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出提取蓮子抗性淀粉的最佳工藝參數(shù).每個(gè)處理重復(fù)3次取平均值，正交試驗(yàn)結(jié)果如表3和表4.

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of L9(34)orthogonal text

由表3可知，各因素對(duì)超聲波-壓熱法制備的蓮子抗性淀粉得率的作用大小為:C(壓熱時(shí)間)＞A(淀粉乳濃度)＞D(壓熱溫度)＞B(超聲波處理時(shí)間).由正交試驗(yàn)結(jié)果得出較佳水平組合為A2B3C3D2.即當(dāng)超聲波功率為300 W時(shí)，淀粉乳濃度45%，超聲波處理時(shí)間55min，壓熱時(shí)間15min，壓熱溫度115℃時(shí)，計(jì)算得出蓮子抗性淀粉理論得率最高可達(dá) 57.27%.

由表4方差分析中顯著性(P值)可知，壓熱時(shí)間(P=0.02)、淀粉乳濃度(P=0.03)對(duì)蓮子淀粉得率的作用顯著，壓熱溫度(P=0.05)對(duì)蓮子抗性淀粉得率作用不顯著.

表4 正交試驗(yàn)的方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal test

采用所得優(yōu)化條件，即淀粉乳濃度45%，超聲波功率300 W，超聲波處理時(shí)間55min，壓熱時(shí)間15min，壓熱溫度115℃，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，得出該條件下蓮子抗性淀粉實(shí)際得率為56.12%，與理論預(yù)測(cè)值57.27%相差2.01%.因此通過正交優(yōu)化后所得的最優(yōu)工藝條件較為可靠，可在超聲波-壓熱法制備蓮子抗性淀粉的過程獲得較高的抗性淀粉含量.

3 結(jié)論

通過試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析得到制備蓮子抗性淀粉的較優(yōu)工藝參數(shù):淀粉乳濃度45%，超聲波功率300 W，超聲波處理時(shí)間55min，壓熱時(shí)間15min，壓熱溫度115℃.在此條件下蓮子抗性淀粉得率為56.12%.

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