齊 慶，李永賢，陳英杰，李東海，朱 珂，查旭山

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院、第一附屬醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2009 級(jí)本科班，廣東 廣州510405）

軟皮湯來(lái)源于鄧鐵濤教授治療硬皮病的理論——硬皮病治療時(shí)應(yīng)以補(bǔ)腎益精為主，健脾養(yǎng)肺為輔。 軟皮湯能減輕患者皮膚硬化癥狀，其具體機(jī)制仍不明確[1-2]。 前期研究提示，在體外其作用靶向于TGF-β 通路[3-4]，可能與活化因子SMAD3、抑制因子FLI1 之間的平衡變化有關(guān)[5]。 然而，機(jī)體復(fù)雜的微環(huán)境有別于體外細(xì)胞模型，諸多因素影響細(xì)胞因子作用；因此，有必要深入開(kāi)展相關(guān)體內(nèi)研究。 本研究將基于小鼠硬皮病模型，繼續(xù)探討軟皮湯在體內(nèi)對(duì)TGF-β 通路中SMAD3、FLI1 等因子“平衡”的影響，現(xiàn)將方法與結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性C57BL/6J 小鼠30 只，6～8 周齡， 體質(zhì)量（20.0±1.4）g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證NO.44008500000277。

1.2 主要試藥與試劑

中藥：補(bǔ)腎益精復(fù)方軟皮湯處方來(lái)源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科， 藥物組成： 阿膠10 g，山茱萸10 g，熟地黃20 g，黃芪30 g，山藥30 g，茯苓15 g，川紅花5 g。 加蒸餾水1 200 mL，浸泡20 min 后， 沸煮45 min， 過(guò)濾收集藥液。100 ℃水浴蒸發(fā)， 使藥液濃縮至134 mL （生藥量0.9 g/mL）。 博來(lái)霉素bleomycin（#9041-93-4）購(gòu)于A(yíng)ladin 公司。 Masson 染色試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所 （#D026）。 抗體：CollagenⅠ(#sc8788)、FLI1 (#sc356) 購(gòu) 于Santa cruz 公 司；Fibronectin(#ab2413) 購(gòu) 于A(yíng)bcam 公 司；SAMD3 （#9532），p-SMAD3（#8828），β-Actin（#3700）購(gòu)于Cell signaling technology 公司。 ECL 發(fā)光試劑盒購(gòu)于廣州永諾生物科技有限公司（#F0010）。

1.3 主要儀器

AB-160 型電子分析天平 （美國(guó)Denver 公司）；Power Tone XL 超薄切片機(jī) （美國(guó)Boeckeler RMC 公司）；Olympus BXDX 光學(xué)顯微鏡 （日本Olympus 公司）；微型電泳電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；BX 51 光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng) （日本Olympus 公司）；CR 21G 高速冷凍離心機(jī) （日本Hitachi 公司）。

1.4 造模與藥物處理[6]

動(dòng)物隨機(jī)分成3 組，每組10 只，實(shí)驗(yàn)前在小鼠背部中央（1 cm×1 cm）剃去毛發(fā)。 正常對(duì)照組：以PBS 溶液100 μL 每日同一位點(diǎn)注射1 次， 生理鹽水(0.2 mL/10 g)每日灌胃1 次。模型對(duì)照組：博來(lái)霉素PBS 溶液1 mg/mL 100 μL 每日同一位點(diǎn)注射1次，生理鹽水(0.2 mL/10 g)每日灌胃1 次。軟皮湯處理組：博來(lái)霉素PBS 溶液1 mg/mL 100 μL 每日同一位點(diǎn)注射1 次， 生藥量0.9g/mL 軟皮湯0.2 mL/10 g 灌胃，每日1 次。 連續(xù)處理4 周后，處死動(dòng)物，收取注射區(qū)域皮膚。

1.5 Masson 染色

皮膚組織經(jīng)多聚甲醛固定、 石蠟包埋后，5 μm連續(xù)切片。 染色前，石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟、水化處理。本實(shí)驗(yàn)按照Masson 染色試劑盒的方法開(kāi)展：（1）細(xì)胞核染液染色2 min，倒掉細(xì)胞核染色液，沖水30 s；（2）胞漿染液染色40 s，倒掉胞漿染色液，沖水30 s；（3）分色液分色8 min；（4）藍(lán)色復(fù)染液染色3 min， 倒掉復(fù)染液， 無(wú)水乙醇沖洗干凈；（5）吹干后用無(wú)毒環(huán)保封固劑封片、鏡檢。

1.6 蛋白提取

稱(chēng)取約100 mg 的組織物， 記下質(zhì)量， 加入700 μL 4 ℃預(yù)冷PBS，剪碎。 點(diǎn)動(dòng)離心，重復(fù)3～4次， 倒去PBS。 加入RIPA 300 μL/100 mg 組織，vortex 震蕩。勻漿機(jī)勻漿5～8 min。設(shè)置聲儀：超聲強(qiáng)度37%，0.8 s/次。超聲12～15 次。16 000 g，4 ℃，離心30 min。 離心結(jié)束后取中間層液體-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測(cè)方法

Western Blot 蛋白定量后， 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)膜。 5%脫脂牛奶封閉后，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。 用TBST 洗膜2 次，每次7 min。 HRP 標(biāo)記二抗室溫下孵育1～2 h，用TBST 洗3 次，每次7 min。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。 用Image J 分析目標(biāo)條帶的光密度值。 以β-Actin 為內(nèi)參照， 比較CollagenⅠ、FLI1、Fibronectin、SAMD3 蛋白表達(dá)的差異。CollagenⅠ、FLI1、Fibronectin、SAMD3 的相對(duì)蛋白表達(dá)量=各個(gè)蛋白的光密度值/β-Actin 光密度值。p-SMAD3 相對(duì)表達(dá)量=各組樣本p-SMAD3 光密度值/ SAMD3光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Masson 三色染色觀(guān)察硬皮病小鼠皮膚纖維化程度

經(jīng)過(guò)Masson 三色染色病理切片，正常組纖維層染色最淺，軟皮湯組稍高；模型組染色最深，顯示其組織的纖維化明顯。 由此可見(jiàn)，硬皮病小鼠經(jīng)過(guò)軟皮湯干預(yù)后，病變皮膚纖維化程度減輕，趨向正常水平。 如圖1 所示（見(jiàn)封三彩圖）。

2.2 各組小鼠皮膚組織CollagenⅠ和Fibronectin 蛋白表達(dá)水平的比較

小鼠皮膚CollagenⅠ和Fibronectin 的蛋白表達(dá)水平，在模型對(duì)照組均高于正常對(duì)照組和軟皮湯組（P＜0.05）。 表明軟皮湯可不同程度抑制模型小鼠皮膚中膠原相關(guān)因子CollagenⅠ、Fibronectin 的表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠皮膚組織CollagenⅠ和Fibronectin 表達(dá)（±s）

表1 各組小鼠皮膚組織CollagenⅠ和Fibronectin 表達(dá)（±s）

注：與正常對(duì)照組比較*P＜0.05；與模型對(duì)照組比較#P＜0.05。 下表同。

組 別正常對(duì)照組模型對(duì)照組軟皮湯組n 10 10 10 Collagen Ⅰ1.00±0.05 3.52±0.16*1.22±0.05*#Fibronectin 1.00±0.04 2.58±0.14*1.31±0.07*#

2.3 各組小鼠皮膚組織中FLI1、SMAD3、p-SMAD3蛋白表達(dá)水平比較

SMAD3 在各組中的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異；FLI1 的表達(dá)水平在模型對(duì)照組中均低于正常對(duì)照組和軟皮湯組。p-SMAD3 在模型對(duì)照組中的表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組和軟皮湯組（P＜0.05）。 結(jié)果顯示， 在硬皮病小鼠皮膚模型中，TGF-β 途徑的p-SMAD3/FLI1 因子表達(dá)比值增大， 而經(jīng)過(guò)軟皮湯干預(yù)后，該比值有一定程度下降，雖與正常組仍有一定差距，但已趨向正常水平。 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠皮膚組織FLI1、p-SMAD3、SMAD3 的表達(dá)（±s）

表2 各組小鼠皮膚組織FLI1、p-SMAD3、SMAD3 的表達(dá)（±s）

組 別正常對(duì)照組模型對(duì)照組軟皮湯組n 10 10 10 FLI1 1.00±0.04 0.33±0.02*0.92±0.05 p-SMAD3 1.00±0.03 4.62±0.23*1.53±0.08*#SMD3 1.00±0.03 0.98±0.05 1.02±0.05

3 討論

硬皮病是復(fù)雜的自身免疫性疾病，臨床辨病呈現(xiàn)病譜性變化，病譜一端為局限性硬皮病，另一端為彌漫型系統(tǒng)性硬皮病，兩者之間包括CREST 綜合征、Sine 硬皮病、嗜酸性筋膜炎等。 中醫(yī)辨證分型主要分為肺脾虧虛型與脾腎虧損型。 雖存異質(zhì)性變化，然其核心病理均不同程度在于：血管損傷、自身免疫、皮膚與內(nèi)臟器官纖維化。 優(yōu)良的動(dòng)物模型是硬皮病研究的重要工具， 相對(duì)硬皮病細(xì)胞模型，硬皮病小鼠能更好地模擬疾病的體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境以及核心病理變化。 本研究使用博萊霉素局部注射構(gòu)建硬皮病小鼠模型[6]，可在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)，刺激成纖維細(xì)胞合成膠原。 在注射博萊霉素后， 小鼠逐漸出現(xiàn)局部皮膚萎縮變硬、毛發(fā)脫落、活動(dòng)減少、食量下降、發(fā)育延緩、體質(zhì)量減輕等表現(xiàn)。 由此可見(jiàn)，該疾病模型體現(xiàn)了硬皮病的主要癥狀，且一定程度地模擬了臨床硬皮病患者的肺脾腎虛損之證。

針對(duì)硬皮病肺脾腎虛損，依“損者益之，虛者補(bǔ)之”補(bǔ)益原則，鄧鐵濤教授主張硬皮病治療宜肺脾腎同治、補(bǔ)腎益精為法[1]。 據(jù)此，擬定治療硬皮病的補(bǔ)腎益精法軟皮湯：熟地黃補(bǔ)腎為君；黃芪、淮山藥、阿膠補(bǔ)脾肺，養(yǎng)陰血，引藥直達(dá)肌表之功為臣；山茱萸、茯苓加強(qiáng)補(bǔ)益脾腎之效為佐；紅花為使，使諸藥補(bǔ)而不滯；全方共奏健脾養(yǎng)肺、補(bǔ)腎益精之效。在臨證中，軟皮湯中藥復(fù)方能不同程度改善患者纖維化癥狀[1-2]。 前期實(shí)驗(yàn)提示，軟皮湯體外作用靶向于TGF-β 通路，與SMAD3、FLI1 平衡變化相關(guān)[5，7]。據(jù)此，本課題組提出SMAD3/FLI1“平衡”的概念。 研究顯示，硬皮病小鼠SMAD3、FLI1 因子失衡，軟皮湯中藥復(fù)方可使硬皮病小鼠TGF-β 通路中活化因子SMAD3 與抑制因子FLI1 再平衡，皮膚纖維化程度減輕，Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白分泌減少。

SMAD3、FLI1 同屬保守的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)，可相互結(jié)合成組織限制性異二聚體， 參與細(xì)胞增殖與組織特異性分化[8]。 在纖維化過(guò)程中， 二者均處于TGFβ 通路下游，效應(yīng)部位位于細(xì)胞核內(nèi)。 當(dāng)TGF-β 通路靜息時(shí)，F(xiàn)LI1 與膠原蛋白啟動(dòng)子結(jié)合， 抑制膠原蛋白轉(zhuǎn)錄；當(dāng)TGF-β 通路活化時(shí)，SMAD3 競(jìng)爭(zhēng)FLI1的啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)膠原蛋白轉(zhuǎn)錄[9-10]。 本研究顯示，軟皮湯組、模型對(duì)照組與正常對(duì)照組活化因子SMAD3 表達(dá)量并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 而三組間主要差異在于磷酸化的SMAD3 因子（p-SMAD3）；軟皮湯使硬皮病小鼠p-SMAD3 減少， 趨向正常對(duì)照組水平，而對(duì)SMAD3 量無(wú)明顯影響；提示中藥復(fù)方對(duì)活化因子SMAD3 的調(diào)節(jié)可能與磷酸化有關(guān)。與國(guó)外研究一致， 磷酸化的SMAD3 因子才是TGF-β 通路活化的標(biāo)志；未磷酸化的SMAD3 位于胞漿內(nèi)；僅當(dāng)TGF-β 通路活化，SMAD3 被TGF-βⅠ型受體磷酸化，與協(xié)同性SMADs 形成復(fù)合物后進(jìn)入核內(nèi)，激活膠原相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[11]。 同時(shí)，軟皮湯中藥復(fù)方增加了硬皮病小鼠體內(nèi)的抑制因子FLI1 表達(dá)，使其趨向正常水平， 可能增強(qiáng)了對(duì)膠原蛋白基因轉(zhuǎn)錄的抑制[9]。然而，中藥復(fù)方通過(guò)何種途徑影響了抑制因子FLI1的表達(dá)，其機(jī)制仍不明確，需要更進(jìn)一步研究。

[1]鄧鐵濤.肺脾腎相關(guān)辨治硬皮病[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2004，2(6)：15-16.

[2]鄭 洪.鄧鐵濤教授治療硬皮病驗(yàn)案2 則[J].新中醫(yī)，2002，34(5)：10.

[3]Varga J，Pasche B.Transforming growth factor beta as a therapeutic target in systemic sclerosis [J]. Nat Rev Rheumatol，2009，5(4)：200-206.

[4]齊 慶，李東海，查旭山，等.補(bǔ)腎益精法對(duì)硬皮病成纖維細(xì)胞表型的影響及其表觀(guān)遺傳學(xué)意義[J].新中醫(yī)，2011，43(2)：134-136.

[5]齊 慶，毛越蘋(píng)，易娟娟，等.補(bǔ)腎益精法對(duì)硬皮病成纖維細(xì)胞SMAD3/FLI1 平衡的影響[J].四川中醫(yī)，2012，30(6)：43-45.

[6]Yamamoto T， Takagawa S， Katayama I， et al. Animal model of sclerotic skin. I： Local injections of bleomycin induce sclerotic skin mimicking scleroderma [J]. J Invest Dermatol，1999，112(4)：456-462.

[7]齊 慶，毛越蘋(píng)，易娟娟，等.補(bǔ)腎益精法中藥復(fù)方對(duì)硬皮病小鼠皮膚纖維化的影響[J].新中醫(yī)，2012，44(6)：149-150.

[8]Ravasi T， Suzuki H， Cannistraci CV， et al. An atlas of combinatorial transcriptional regulation in mouse and man [J]. Cell，2010，140(5)：744-752.

[9]Asano Y，Bujor AM，Trojanowska M. The impact of Fli1 deficiency on the pathogenesis of systemic sclerosis [J]. J Dermatol Sci，2010，59(3)：153-162.

[10]Trojanowska M. Noncanonical transforming growth factor beta signaling in scleroderma fibrosis [J]. Curr Opin Rheumatol，2009，21(6)：623-629.

[11]Seuntjens E， Umans L， Zwijsen A， et al. Transforming Growth Factor type beta and Smad family signaling in stem cell function [J]. Cytokine Growth Factor Rev，2009，20 (5-6)：449-458.

圖1 各組大鼠回盲部腸黏膜切片電鏡觀(guān)察圖（HE，×400）