金 玲，易建國(guó)，王春風(fēng)，江興林*，李洪亮，曹湘玉

（湖南醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，湖南 懷化418000）

腦性癱瘓(簡(jiǎn)稱腦癱)是各種原因所引起的腦損傷或發(fā)育缺陷所致的運(yùn)動(dòng)障礙及姿勢(shì)異常的一種疾病，是繼脊髓灰質(zhì)炎基本被控制之后，兒童肢體殘疾的主要疾病。 以往多從腦癱的病因、病理學(xué)研究來(lái)探討腦癱的發(fā)病機(jī)制，尚未獲理想的效果。 神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1，商品名“申捷”)是一種腦神經(jīng)保護(hù)劑， 具有刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后潛在的代償機(jī)制，促進(jìn)“ 神經(jīng)重構(gòu)”（包括神經(jīng)細(xì)胞的生存、軸突和突觸生長(zhǎng)），在細(xì)胞的發(fā)育、分化、修復(fù)神經(jīng)組織、神經(jīng)元的可塑性等方面起著重要作用，國(guó)內(nèi)尚未查到從分子生物水平研究GM1治療腦性癱瘓大鼠康復(fù)機(jī)制的文獻(xiàn)報(bào)道。 因此我們采用大鼠腦外傷模型，觀察應(yīng)用GM1后各時(shí)間點(diǎn)腦外傷大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（growth associated protein 43，GAP-43）表達(dá)的變化，了解藥物對(duì)大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，初步探討藥物干預(yù)對(duì)腦外傷大鼠受損神經(jīng)功能修復(fù)的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用藥物治療腦癱提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 現(xiàn)將方法和結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取出生10 周并經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d、體質(zhì)量在200～250 g 的SD 大鼠200 只，來(lái)源于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司， 合格證書(shū)號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。 適應(yīng)性喂養(yǎng)的飼料及屏蔽環(huán)境實(shí)驗(yàn)設(shè)施由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 （SPF 級(jí)）提供，在光/暗周期為12 h/12 h(光照時(shí)間7：00-9：00）的條件下飼養(yǎng)于籠中，自由獲得飼料和飲水。

1.1.2 藥物 神經(jīng)節(jié)苷脂(GMl，商品名“申捷”，北京四環(huán)制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：4010531，注射劑，2 mg/mL)。

1.1.3 主要儀器和試劑 芬蘭352 型352017148 酶標(biāo)分析儀，芬蘭AC8 型洗板機(jī)。GAP-43 酶聯(lián)免疫分析試劑盒，批號(hào)：2010207，購(gòu)自北京永輝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 200 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組60 只，GM1組和模型組各70 只。

1.2.2 動(dòng)物造模 腦外傷造模方法按楚勝華等［1］運(yùn)用特制的造模打擊裝置， 以自由落體撞擊致使動(dòng)物腦外傷模型。 大鼠手術(shù)與腦外傷造模前禁食8 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠俯臥位固定于腦立體定向儀上， 消毒頭部皮膚，按0.35 g/kg 腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，正中切開(kāi)頭皮后剝離骨膜，充分暴露右頂骨，用牙科鉆在冠狀縫后1.5 mm、 中線旁2.5 mm 處鉆一直徑5 mm 的骨窗，并保持硬膜完整。 假手術(shù)組：不施加砝碼撞擊即封閉頭皮，未致腦外傷。 模型組和GM1組：用20 g 砝碼于30 cm 高處墜落，撞擊撞桿從而撞擊硬膜，致右頂葉中度腦挫裂傷，最后封閉頭皮。 術(shù)后蘇醒再帶回到原飼養(yǎng)處喂養(yǎng)，并按楚勝華的曠野試驗(yàn)等［1］行為學(xué)測(cè)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)確定大鼠腦受損的行為學(xué)表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)完成后剩余腦外傷大鼠一律處死。

1.2.3 給藥方法 假手術(shù)組、 模型組均按20 mL/（kg·d） 腹 腔 注 射 生 理 鹽 水；GM1組 給 予 濃 度 為2 mg/mL 的GM1注射液按20 mL/（kg·d）腹腔注射，以上各組每天1 次，術(shù)前連續(xù)注射3 d。

1.2.4 標(biāo)本采集 （1） 造模后在0、2、4、8、12、16、24 h 時(shí)間點(diǎn)，分別在各組中提出6 只大鼠，以頸動(dòng)脈取血后處死大鼠；（2）采大腦皮質(zhì)組織標(biāo)本方法：剪斷頭顱，沿正中線切開(kāi)頭皮，剝開(kāi)顱骨，暴露完整的大腦組織，撕開(kāi)硬腦膜后，用彎鑷取出大腦最外層頂葉皮質(zhì)放入標(biāo)記好的冰凍管， 經(jīng)液氮速凍后，放入-80 ℃冰箱保存；（3） 采大腦海馬組織標(biāo)本方法：取腦并切除下丘腦，剪斷前聯(lián)合，切除小腦和腦干，沿大腦矢狀裂將大腦半球縱行切開(kāi)，剝離枕葉內(nèi)側(cè)丘腦及紋狀體，暴露邊緣系統(tǒng)，用小藥匙輕輕剝離雙側(cè)海馬組織， 放入凍存管， 經(jīng)液氮速凍后，于-80 ℃保存；（4）所有的標(biāo)本處理好后，分別稱取各份標(biāo)本2 g， 加入pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液2 mL中， 將標(biāo)本充分研成勻漿，2 000 r/min 離心20 min，收集上清液，分裝后冷凍備用。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 GAP-43 檢測(cè) 按GAP-43 酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作使用說(shuō)明進(jìn)行測(cè)量。 即通過(guò)包被、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物液顯色、終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上于450 nm 波長(zhǎng)處，以空白管調(diào)零測(cè)定吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠樣品中GAP-43 濃度。

1.3.2 動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè) 分別于術(shù)后第1～5 天時(shí)間點(diǎn)，由3 組隨機(jī)各取6 只實(shí)驗(yàn)大鼠，在標(biāo)本采集前進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能計(jì)分檢測(cè)，通過(guò)不自主動(dòng)作、曠場(chǎng)試驗(yàn)、傾斜板試驗(yàn)、拒俘反應(yīng)檢測(cè)測(cè)試肢體肌力、隨意運(yùn)動(dòng)和情感行為能力[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)大腦皮質(zhì)區(qū)GAP-43 表達(dá)的比較

與假手術(shù)組 0～24 h 的GAP-43 表達(dá)比較，模型組明顯高于假手術(shù)組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），但GM1組隨著時(shí)間的增加而升高，至24 h 已達(dá)模型組水平；GM1組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)8～24 h GAP-43 的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 GM1組與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較（P＜0.01）。 結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)大腦海馬區(qū)GAP-43 表達(dá)的比較

與假手術(shù)組大鼠大腦海馬區(qū)0～24 h 的GAP-43 表達(dá)，模型組各時(shí)間點(diǎn)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；GM1組大鼠大腦海馬區(qū)GAP-43的表達(dá)與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)大腦皮質(zhì)區(qū)GAP-43 表達(dá)的比較 （n=6，±s，ng/L）

表1 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)大腦皮質(zhì)區(qū)GAP-43 表達(dá)的比較 （n=6，±s，ng/L）

注：與假手術(shù)組比較△△P＜0.01；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較**P＜0.01。 表2 同。

組 別假手術(shù)組模型組GM1 組0 h 2 525.4±179.9 3 539.6±267.4△△2 679.6±164.1**2 h 2 837.0±359.3 3 547.2±115.6△△2 703.2±115.6**4 h 2 730.9±256.6 3 262.5±306.4△△2 726.2±191.3**8 h 2 555.0±296.2 3 748.3±197.8△△2 747.5±270.0**△△12 h 2 744.5±256.9 3 935.2±102.3△△2 946.7±174.5**△△16 h 2 458.3±189.0 3 559.2±235.6△△3 045.6±208.4**△△24 h 2 867.8±361.2 3 132.8±109.9△△3 185.8±186.9△△

表2 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)大腦海馬區(qū)GAP-43 表達(dá)的比較 （n=6，±s，ng/L）

表2 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)大腦海馬區(qū)GAP-43 表達(dá)的比較 （n=6，±s，ng/L）

組 別假手術(shù)組模型組GM1 組0 h 2 643.7±361.6 3 188.6±206.7△△2 875.5±317.2**2 h 2 598.7±393.8 4 465.0±391.5△△2 795.1±289.3**4 h 2 471.8±275.7 3 958.8±366.8△△2 698.9±252.3**8 h 2 576.3±279.4 3 036.9±364.4△△2 611.5±280.9**12 h 2 849.4±277.5 3 571.8±110.9△△2 641.2±133.9**16 h 2 561.3±101.3 3 384.4±285.9△△2 663.4±189.9**24 h 2 744.4±322.4 3 644.6±308.8△△2 694.8±130.3**

2.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)檢測(cè)評(píng)分比較

假手術(shù)組大鼠運(yùn)動(dòng)能力術(shù)后第1～5 天不同時(shí)間點(diǎn)都是較強(qiáng)的， 得分顯著高于模型組和GM1組（P＜0.01）。 GM1組大鼠手術(shù)后2～5 d 運(yùn)動(dòng)能力逐步增強(qiáng)，且明顯高于模型組（P＜0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)評(píng)分的比較 （±s，分）

表3 各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)行為學(xué)評(píng)分的比較 （±s，分）

注：與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較**P＜0.01；與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較△P＜0.05。

組 別假手術(shù)組模型組GM1 組n 6 6 6第1 天19.5±0.2 6.4±0.1**7.8±0.1**第2 天20.1±0.2 6.7±0.1**9.8±0.2**△第3 天19.3±0.2 6.3±0.2**13.4±0.2**△第4 天19.8±0.2 6.0±0.3**14.0±0.1**△第5 天19.2±0.2 6.9±0.3**15.9±0.2**△

3 討論

GAP-43 是一種特異性胞膜磷酸蛋白， 參與軸突的生長(zhǎng)、突觸發(fā)育形成和神經(jīng)再生，在神經(jīng)再生時(shí)呈高表達(dá)狀態(tài)，但隨著損傷修復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸回落，直至再生完成。因此GAP-43 被很多學(xué)者認(rèn)為是研究腦損傷修復(fù)的首選標(biāo)志物之一[3]。 有研究證實(shí)，GAP-43 表達(dá)增加可以促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞和在體的軸突生長(zhǎng)[4]；Haynes 等[5]發(fā)現(xiàn)腦室周?chē)踪|(zhì)軟化（PVL） 大鼠壞死灶區(qū)域可以檢測(cè)到GAP-43 的表達(dá)， 說(shuō)明該處的組織壞死可以導(dǎo)致GAP-43 保護(hù)性的表達(dá)上調(diào)；Farina V 等[6]研究表明GAP-43 在應(yīng)激效應(yīng)后3 d 才出現(xiàn)表達(dá)高峰；林棟等[7]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血缺氧大鼠治療7 d 后取材，GAP-43 表達(dá)水平未有顯著變化，說(shuō)明取材時(shí)間點(diǎn)的不同會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。

參考以上文獻(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)充分考慮了腦外傷治療中藥物干預(yù)特點(diǎn)， 并結(jié)合不同時(shí)間的作用結(jié)果， 即在干預(yù)研究中動(dòng)態(tài)地納入時(shí)間因素分析，在不同療法的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上觀測(cè)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化，從而客觀地反映不同干預(yù)方法對(duì)研究對(duì)象的影響。 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)用了200 只大鼠，手術(shù)腦外傷造模前3 d 開(kāi)始給藥GM1注射液和生理鹽水，每天1 次，連續(xù)3 d。 運(yùn)用GM1的目的既可增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子活性，又可減輕造模時(shí)大鼠神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死和凋亡，希望能增加動(dòng)物造模的成功系數(shù)。 因此，采用這些保護(hù)性措施，注射了GM1注射液的GM1組自然死亡的大鼠較少，模型組死亡的大鼠較多，這說(shuō)明在腦損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，預(yù)防性的給藥GM1可提高腦損傷大鼠造模的成功率，降低死亡率，本實(shí)驗(yàn)中各組死亡率比較已另有論文發(fā)表[8]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：GM1組大鼠大腦皮質(zhì)0～16 h 和海馬區(qū)0～24 h GAP-43 的表達(dá)均低于模型組，有顯著差異；行為學(xué)表現(xiàn)優(yōu)于模型組。GM1組大鼠大腦皮質(zhì)GAP-43 0～4 h 的表達(dá)與假手術(shù)組比， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，8～24 h 表達(dá)升高且明顯高于假手術(shù)組，這說(shuō)明造模前用藥GM1對(duì)腦損傷起到了保護(hù)作用，故行為學(xué)表現(xiàn)優(yōu)于模型組。 大鼠大腦海馬區(qū)GAP-43 的表達(dá)0～24 h 均無(wú)明顯上升，說(shuō)明GM1對(duì)海馬區(qū)無(wú)明顯作用。GM1組大腦皮質(zhì)GAP-43 8～16 h 表達(dá)逐步上升，大于假手術(shù)組，低于模型組，至24 h達(dá)到模型組水平，這說(shuō)明GM1延緩了GAP-43 的表達(dá)高峰，這和Farina V 等[6]的觀點(diǎn)即GAP-43 表達(dá)要在腦損傷后3 d 才出現(xiàn)表達(dá)高峰較為一致。

該研究結(jié)果證實(shí)：預(yù)防性使用GM1可以有效地促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性腦外傷大鼠大腦皮質(zhì)GAP-43 的表達(dá)升高，降低腦損傷的程度，增強(qiáng)腦外傷動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)。 因此， 該研究提示是否能在臨床上盡早使用GM1，最好在產(chǎn)婦住院生產(chǎn)前預(yù)防性使用GM1，從而有效阻斷腦損傷的發(fā)生、發(fā)展，或者降低腦損傷患兒病死率和致殘率。 該研究為腦損傷的預(yù)防以及臨床治療提供了新的思路和研究基礎(chǔ)。

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圖1 Masson 三色染色皮膚組織圖（×200）