羅永富，龔宗躍

（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012）

人乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）是引起尖銳濕疣的主要病原體，目前還不能進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，且其抗原接觸免疫系統(tǒng)的機(jī)會(huì)少，難以用檢測(cè)抗體的方法診斷。PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）檢測(cè)病毒DNA序列具有特異和敏感等特點(diǎn)，但需要特殊的儀器設(shè)備，且對(duì)檢測(cè)人員有較高的技術(shù)要求，難以用于基層。本研究采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）結(jié)合熒光染色檢測(cè)HPV，對(duì)尖銳濕疣的預(yù)防、早期快速診斷和治療具有特別重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本 所有臨床標(biāo)本均取自株洲市二醫(yī)院皮膚科2011年5月至2012年8月期間的門診患者，共76例。男性54例，其中20～30歲患者28例，30～40歲患者19例，40～50歲患者7例；女性患者22例，其中20～30歲患者15例，30～40歲患者6例，40～50歲患者1例。標(biāo)本均由門診醫(yī)生采集，用棉拭子在患者外陰部疑似病灶部位涂抹，置于裝有1mL無(wú)菌生理鹽水的試管中送檢。

1.1.2 試劑 針對(duì)HPV-6 E6基因（基因序號(hào)：AF092932）的174～381 bp序列和HPV-11 E6基因（基因序號(hào)：M14119）的129～306 bp區(qū)域序列，利用專用引物軟件（Primer Explorer V4）分別設(shè)計(jì)兩型HPV的4條LAMP引物，引物由廣州英駿公司合成并分別配制成HPV-6引物液和HPV-11引物液；100 bp DNA Ladder（BioDev公司）；限制性內(nèi)切酶（Pro mega公司）；Taq plus DNA聚合酶（北京鼎國(guó)公司）；Betaine（Fluka公司）；Bst DNA Polymerase（Biolabs公司）；DNA Maker I（天根公司）；dNTP（北京鼎國(guó)公司）；一管式病毒DNA提取試劑盒（四川天澤公司）；MgSO4（Sigama公司）；SYBR Green I（北京天恩澤基因科技有限公司）。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理與核酸提取液制備 送檢標(biāo)本充分振蕩懸浮，擠干棉拭子中的水分，棄棉拭子，15000 r/min離心5分鐘，棄上清液，留沉淀，加600μL病毒DNA提取液充分混勻，加700μL異丙醇，振蕩混勻，12000 r/min離心1分鐘，棄上清液，沉淀用75%乙醇洗滌2次，12000 r/min離心1分鐘，棄上清液，將離心管倒置于濾紙上10～15分鐘，待酒精揮發(fā)完后加入100μLTE溶液，4℃過(guò)夜充分溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。沙眼衣原體陽(yáng)性標(biāo)本同樣處理，作為陰性對(duì)照備用。

1.2.2 LAMP取反應(yīng)杯4只，1號(hào)和2號(hào)為待測(cè)杯，3號(hào)和4號(hào)為沙眼衣原體陽(yáng)性標(biāo)本核酸提取液的陰性對(duì)照杯。具體方法見(jiàn)表1。

表1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）

混勻，置于65℃孵育擴(kuò)增60分鐘，然后置于80℃2分鐘滅活酶，終止擴(kuò)增。

1.2.3 染色與結(jié)果觀察 每只反應(yīng)杯中加入熒光染料SYBR Green I 1.0μL，混勻，置于紫外燈下觀察結(jié)果。反應(yīng)混合物變綠為陽(yáng)性；保持SYBR Green I的橙色不變?yōu)殛幮訹1]。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

陰性對(duì)照標(biāo)本為陰性。LAMP檢測(cè)76例臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，23例為HPV-6陽(yáng)性，18例為HPV-11陽(yáng)性，合計(jì)41例陽(yáng)性，總檢出率為53.95%。PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25例為HPV-6陽(yáng)性，15例為HPV-11陽(yáng)性，合計(jì)40例陽(yáng)性，總檢出率為52.63%。在LAMP檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本中，有6例PCR檢測(cè)為陰性，而PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本中，有5例LAMP檢測(cè)為陰性。各臨床病例標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 76例臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)（例）

經(jīng)方差分析：χ2=0，P>0.05，LAMP與PCR的檢出率無(wú)顯著性差異。

3 討論

（1）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[2]針對(duì)靶基因6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）在恒溫條件下完成擴(kuò)增，擴(kuò)增效果可用凝膠電泳、比濁、染色等多種方法檢測(cè)，具有反應(yīng)時(shí)間短、肉眼可判斷結(jié)果和不需要PCR儀等優(yōu)點(diǎn)。眾多學(xué)者嘗試?yán)迷摷夹g(shù)對(duì)多種病原體進(jìn)行檢測(cè)的方法研究，取得了令人滿意的結(jié)果[3-6]。本報(bào)導(dǎo)是在實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行的臨床實(shí)際應(yīng)用并與PCR方法比對(duì)的研究。

（2）人乳頭瘤病毒6型和11型引起的傳染性疾病是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，也被認(rèn)為是人類生殖器癌潛在的主要致病因素[7-10]。探索適應(yīng)基層醫(yī)療單位特異、快速、敏感及簡(jiǎn)便的臨床人乳頭瘤病毒檢測(cè)方法具有重要的社會(huì)價(jià)值和理論意義。本研究為L(zhǎng)AMP的臨床應(yīng)用做了有益的探索。

（3）統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，LAMP與PCR的陽(yáng)性檢出率無(wú)顯著性差異（χ2=0，P>0.05），說(shuō)明LAMP完全可以替代PCR，可作為基層醫(yī)療單位臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)方法推廣應(yīng)用。

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