袁 遠(yuǎn)，張麗芳，吳國星，朱家穎

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201;2.西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

微衛(wèi)星(microsatellite)又稱簡單序列重復(fù)或短串聯(lián)重復(fù)，是指以1-6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的重復(fù)序列，由Miesfeld (1981)等在1981年首次發(fā)現(xiàn)。它們主要以2-3個(gè)堿基重復(fù)類型為主，廣泛分布于原核生物以及真核生物基因組中(崔建洲等，2006;史潔等，2012)。微衛(wèi)星不僅具有豐富的多態(tài)性、高度的雜合性和良好的穩(wěn)定性，而且遵循孟德爾分離定律，呈現(xiàn)共顯性遺傳，具有容易操作和檢測等優(yōu)點(diǎn)(宋來鵬等，2008;張俊娥，2012)。因此，該標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于基因組遺傳連鎖圖構(gòu)建、基因定位與克隆、分子標(biāo)記輔助育種、種群遺傳多樣性分析和家系識別等領(lǐng)域(Beheregaray et al，2003;Hadonou et al.，2004)。

云南切梢小蠹Tomicus yunnanensis (Coleoptera:Scolytinae)是危害云南松Pinus yunnanensis的主要次期性蛀干害蟲，其在云南紅河、楚雄、曲靖、玉溪、安寧、昆明等多地州縣市猖獗危害，且近年來呈現(xiàn)擴(kuò)大和蔓延的趨勢 (牛明德和盧南，1992;Kikendall et al.，2008)。因該害蟲具有危害隱蔽、危害期長、防治困難等特點(diǎn)，對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重破壞，并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(李麗莎等，1997)。迄今，有關(guān)該害蟲的研究，主要集中在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)以及防治措施等領(lǐng)域，甚少有關(guān)遺傳背景和分子生物學(xué)方面的研究(閆爭亮等，2011)。有鑒于此，本文基于已構(gòu)建的云南切梢小蠹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，對其微衛(wèi)星進(jìn)行了高通量發(fā)掘，旨在為今后研發(fā)高多態(tài)性微衛(wèi)星引物，對該害蟲進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)、種群遺傳多樣性、功能基因組學(xué)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

云南切梢小蠹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)采用二代測序技術(shù)構(gòu)建獲得(Zhu et al.，2013a)，有關(guān)數(shù)據(jù)全部提交到DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp/)數(shù)據(jù)庫中，登錄號為DRA000917。

1.2 微衛(wèi)星篩選

利用M1SA 軟件(Micro Satellite) (http://www.pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫序列中的微衛(wèi)星進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為:單核苷酸重復(fù)的次數(shù)在12 次或12 次以上，二核苷酸重復(fù)的次數(shù)在6 次或6 次以上，三和四核苷酸重復(fù)的次數(shù)在5 次或5 次以上，五和六核苷酸重復(fù)的次數(shù)在4 次或4 次以上，并且兩個(gè)相鄰微衛(wèi)星重復(fù)單元之間的最小長度設(shè)為100 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星重復(fù)單元的種類和數(shù)目

從構(gòu)建的云南切梢小蠹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，獲得84899 條基因序列，長為32595681 bp。這些基因序列經(jīng)M1SA 軟件搜尋，共得到1098個(gè)微衛(wèi)星序列，占總搜尋基因序列總數(shù)的1.29%，平均每29686 bp 中就存在1個(gè)微衛(wèi)星。

在發(fā)掘獲得的微衛(wèi)星中，不同重復(fù)單元的數(shù)目如表1 所示。其中，三核苷酸微衛(wèi)星重復(fù)單元有482個(gè)，占重復(fù)單元總數(shù)目的43.90%;其次是單核苷酸微衛(wèi)星重復(fù)單元，有420個(gè)，占總數(shù)目的38.25%;再次是二、四和五核苷酸微衛(wèi)星重復(fù)單元，分別為169、12 和12個(gè)，分別占總數(shù)目的15.39%、1.09%和1.09%;最少的是六核苷酸的微衛(wèi)星重復(fù)單元，僅有3個(gè)，占總數(shù)目的0.27%。

表1 云南切梢小蠹轉(zhuǎn)錄組中不同長度重復(fù)單元微衛(wèi)星所占比例Table 1 Frequency of microsatellites based on the number of repeat units in Tomicus yunnanensis transcriptome

2.2 微衛(wèi)星不同重復(fù)單元的分布

云南切梢小蠹不同重復(fù)單元的分布情況較為豐富，如表1 所示。單核苷酸重復(fù)單元中，重復(fù)次數(shù)最多的是14 次，為156個(gè);二核苷酸重復(fù)單元中，重復(fù)次數(shù)最多的是6 次，為95個(gè);三核苷酸重復(fù)單元中，重復(fù)次數(shù)最多的是大于5 次，為364個(gè);四核苷酸重復(fù)單元中，重復(fù)次數(shù)最多的是5 次，為11個(gè);五核苷酸重復(fù)單元中，重復(fù)次數(shù)最多的是4 次，為11個(gè);六核苷酸重復(fù)單元中，重復(fù)次數(shù)最多的為4 次，為2個(gè)。在六種核苷酸重復(fù)單元中，重復(fù)次數(shù)最多的是5 次，為386個(gè)，占微衛(wèi)星總數(shù)的31.60%;重復(fù)次數(shù)排第二的是6 次，為190個(gè)，占微衛(wèi)星總數(shù)的16.94%;重復(fù)次數(shù)最少的是10 次，為6個(gè)，僅占微衛(wèi)星總數(shù)的0.18%。

2.3 微衛(wèi)星不同重復(fù)類型的分布情況

云南切梢小蠹微衛(wèi)星不同重復(fù)類型的分布情況如表2 所示。在A/T 和C/G 兩種單堿基重復(fù)類型中，優(yōu)勢重復(fù)單元為A/T，為367個(gè)，占微衛(wèi)星總數(shù)的33.42%，重復(fù)次數(shù)最多的是12 次，為142個(gè)。在AC/GT、AG/CT、AT/AT 和CG/CG 四種二堿基重復(fù)類型中，優(yōu)勢重復(fù)單元為AT/AT，為67個(gè)，占微衛(wèi)星總數(shù)的6.10%，重復(fù)次數(shù)最多的是6 次，為45個(gè)。在AAC/GTT、AAG/CTT、AAT/ATT、ACC/GGT、ACG/CGT、ACT/AGT、AGC/CTG、AGG/CCT、ATC/ATG 和CCG/CGG 十種三堿基重復(fù)類型中，優(yōu)勢重復(fù)單元為AAT/ATT和ATC/ATG，都為83個(gè)，占微衛(wèi)星總數(shù)的7.56%，重復(fù)次數(shù)最多的都是5 次，分別為49 和48個(gè)。AAAT/ATTT 四堿基重復(fù)單元為6個(gè)，占微衛(wèi)星總數(shù)的0.55%，重復(fù)次數(shù)最多的是5 次，為5個(gè)。其它堿基重復(fù)單元為21個(gè)，占微衛(wèi)星總數(shù)的1.91%，重復(fù)次數(shù)最多的是4 次，為13個(gè)。

表2 云南切梢小蠹轉(zhuǎn)錄組中不同重復(fù)類型微衛(wèi)星所占比例Table 2 Frequency distribution ofmicrosatellites based on motif sequence types in Tomicus yunnanensis transcriptome

3 結(jié)論與討論

以往微衛(wèi)星的發(fā)掘主要是通過構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫，然后對文庫進(jìn)行大規(guī)模測序獲得，這種方法雖然有效，但一般較為耗時(shí)并需要大量資金(Arthofer et al.，2011)。隨著基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們現(xiàn)在已經(jīng)可以通過已經(jīng)測通的基因組，對一些物種的微衛(wèi)星進(jìn)行高通量發(fā)掘，但這些研究僅限于基因組學(xué)被測通的物種 (Lovin et al.，2009)。近年來，隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，諸多物種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫已被構(gòu)建，不少學(xué)者正試圖基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫高通量篩選微衛(wèi)星(Bai et al.，2011;Zhu et al.，2013b)。本研究基于先前構(gòu)建的云南切梢小蠹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘獲得了1098個(gè)微衛(wèi)星，其中平均29686 bp 中就有一個(gè)微衛(wèi)星，占整個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基因序列的1.29%。這一比例比其他昆蟲基于全基因組數(shù)據(jù)鑒定獲得的微衛(wèi)星比例小，應(yīng)該是由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)量遠(yuǎn)比全基因組數(shù)據(jù)量少的原因(Archak et al.，2007)。但是，研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是有效高通量發(fā)掘微衛(wèi)星的有效方法之一。在鑒定獲得的云南切梢小蠹微衛(wèi)星中，與其它研究結(jié)果相似，三核苷酸重復(fù)序列的數(shù)目是最高，為最主要的核苷酸重復(fù)序列(Xu et al.，2012)。而且，以往的研究證明，三堿基重復(fù)單元出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象很少，是較好的引物開發(fā)資源(張俊娥，2012)。在核苷酸重復(fù)單元中，重復(fù)次數(shù)最多的是5 次，占微衛(wèi)星總數(shù)的31.60%。Smulders (1997)認(rèn)為，重復(fù)次數(shù)多的微衛(wèi)星既能在種間又能在種內(nèi)產(chǎn)生豐富的多態(tài)性。為此，雖然一些重復(fù)次數(shù)多的重復(fù)單元占有的比例不大，但有很大的可能性被開發(fā)為有效微衛(wèi)星分子標(biāo)記。這些微衛(wèi)星的獲得，為今后開發(fā)高多態(tài)性微衛(wèi)星引物來研究云南切梢小蠹種群遺傳結(jié)構(gòu)、種群遺傳多樣性、功能基因組學(xué)等具有重要意義。

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