趙艷琴，吳元華，趙秀香，安夢楠，陳建光

1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)/植物保護(hù)學(xué)院,遼寧沈陽市東陵路120號 110866；

2 內(nèi)蒙古民族大學(xué)/農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼霍林河大街22號 028043

煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）SRAP-PCR 體系建立及優(yōu)化

趙艷琴1，2，吳元華1，趙秀香1，安夢楠1，陳建光1

1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)/植物保護(hù)學(xué)院,遼寧沈陽市東陵路120號 110866；

2 內(nèi)蒙古民族大學(xué)/農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼霍林河大街22號 028043

采用煙草靶斑病菌YC-9, LJT-8和QYS-7為DNA模板,初步篩選SRAP引物組合；采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),對煙草靶斑病菌的SRAP-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs, Taq DNA聚合酶、引物和DNA模板濃度等5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明：共篩出13對擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性好的引物組合；煙草靶斑病菌的最佳SRAP反應(yīng)體系為Mg2+濃度2.0 mmol/L、dNTP濃度200 μmol/L、Taq DNA聚合酶0.8 U、引物濃度140 mmol/L、模板DNA 20 ng及1×PCR buffer,反應(yīng)總體積為20 μL；各因素對SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果影響的差異較大,依次為Taq DNA聚合酶＞引物＞ Mg2+＞ dNTPs=模板DNA。

煙草靶斑病菌；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；反應(yīng)體系優(yōu)化；引物篩選

SRAP (Sequence related amplified polymorphism)技術(shù)是2001年Li和Quiros在蕓苔屬植物上開發(fā)出的新型分子標(biāo)記技術(shù)[1]。該技術(shù)無需任何序列信息即可直接 PCR 擴(kuò)增,從DNA 水平上直接檢測基因組DNA 的多態(tài)性[2],相比此前廣為應(yīng)用的RAPD(Random amplification polymorphism DNA)技術(shù)以及AFLP (Amplified fragment length poly-morphism)等技術(shù),SRAP技術(shù)穩(wěn)定性和重復(fù)性好,并且成本低,簡單快速[3]。目前SRAP技術(shù)已成功在多種植物遺傳圖譜和多樣性分析的研究中應(yīng)用[4-5],以及在植物病原物的遺傳多樣性研究中應(yīng)用[6-7]。

煙草靶斑?。═hanatephorus cucumeris(Frank)Donk）在許多國家都有發(fā)生[8-10],是一種危害嚴(yán)重的煙草葉部病害。我國煙草靶斑病主要發(fā)生在煙草旺長期和成熟期,潛育期短、流行性強(qiáng),嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量[11]。煙草靶斑病菌的無性態(tài)為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）,目前針對我國煙草靶斑病菌的研究報(bào)道較少[12-14]。為明確煙草靶斑病菌的遺傳多樣性及進(jìn)化背景,本文建立了煙草靶斑病菌SRAPPCR反應(yīng)體系,并對引物進(jìn)行了篩選,以期早日明確煙草靶斑病菌的遺傳本質(zhì),為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

煙草靶斑病菌株YC-9,LJT-8和QYS-7,分別分離自鐵嶺市營廠鄉(xiāng),李家臺鄉(xiāng)及丹東市青椅山煙草靶斑病菌組織,保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測

首先將菌株移植于PDA平板上,在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后,取5 mm直徑的菌餅至含有10 mL的PD培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿（9 cm）中,于28 ℃下靜置培養(yǎng)3 d,過濾出菌絲,用無菌水沖洗,無菌濾紙吸干水分后于40℃干燥4 h后裝入1.5 mL的離心管中,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提取采用北京天根生物技術(shù)公司DNA提取試劑盒按照說明進(jìn)行,并采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.2.2 SRAP引物篩選

SRAP引物采用Li等已發(fā)表的序列Me1～Me10/Em1～Em10[1],由上海生工生物有限公司合成。選取菌株YC-9、LJT-8和QYS-7,對100對SRAP引物進(jìn)行多態(tài)性初篩。

1.2.3 SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序

基礎(chǔ)反應(yīng)體積為20 μL：l0×PCR buffer (Mg2+)2 μL, Mg2+0.2 μL, 10 mmol/L dNTPs (10 mmol/L Each) 1.6 μL, 正 反 向 引 物 (10 μmol/L)各 0.5 μL, TaqDNApolymerase (2.5 U/μL) 0.32 μL,模板DNA1.0 μL,用ddH2O定容至20 μL。

反應(yīng)程序參照Li等的方法略加修改[1], 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min, 35 ℃ 1 min, 72 ℃ l min, 4 個(gè)循環(huán) ;94 ℃ 1 min, 56 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 39 個(gè)循環(huán) ;72 ℃10 min, 4 ℃保存。

擴(kuò)增結(jié)束后,取7.5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物,與1.5 μL 6×Loading Buffer（TaKaRa）混勻,點(diǎn)入含0.5 μg/mL Goldview 的1.5% 瓊脂糖凝膠中,以 DNA Marker DL2000（Tiangen）作為分子量標(biāo)準(zhǔn),在 5 V/cm 電場強(qiáng)度下電泳 1～2 h,紫外凝膠成像儀下照相。

1.2.4 SRAP 反應(yīng)體系優(yōu)化

選取質(zhì)量較好的菌株DNA作為模板及多態(tài)性好的一組SRAP引物進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化試驗(yàn)。首先按照表1進(jìn)行單因素優(yōu)化,以確定各因子的適宜濃度范圍,在此基礎(chǔ)上參照表2采用五因素四水平L16（45）進(jìn)行正交優(yōu)化。參考張麗等分析統(tǒng)計(jì)方法[15],對 Mg2+、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物以及模板DNA濃度水平進(jìn)行優(yōu)化以獲得穩(wěn)定的反應(yīng)體系。

表1 單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab.1 Single-factor experiment

表2 煙草靶斑病菌SRAP-PCR反應(yīng)體系的L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab.2 An orthogonal design of L16(45) of SRAP-PCR reaction system for Rhizoctonia solani from tobacco target spot

表2（續(xù)）

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP引物篩選

選取YC-9、LJT-8和QYS-7菌株對100對SRAP引物進(jìn)行篩選,圖1結(jié)果表明：篩選獲得13組條帶清晰且多態(tài)性好的引物組合,分別是Me1/Em2、Me3/Em2、Me3/Em9、Me4/Em4、Me4/Em6、Me4/Em9、Me5/Em3、Me5/Em9、Me6/Em2、Me6/Em8 和Me7/Em10 Me8/Em7和 Me9/Em5。

圖1 優(yōu)化SRAP反應(yīng)體系部分引物中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplified results of partial primer in the optimization of SRAP reaction system

2.2 SRAP反應(yīng)體系優(yōu)化

選擇煙草靶斑病菌YC-9 基因組DNA及SRAP引物組合Me7/Em10進(jìn)行體系優(yōu)化。

2.2.1 Mg2+濃度

圖2試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)Mg2+濃度為1.0 mmol/L時(shí),僅有較少的擴(kuò)增條帶數(shù)和擴(kuò)增量；當(dāng)Mg2+為1.5～2.5 mmol/L時(shí),能獲得較清晰的譜帶且譜帶數(shù)量增多,其中以2.5 mmol/L 的Mg2+濃度最佳；當(dāng)Mg2+為3.0～4.5 mmol/L時(shí),隨著Mg2+濃度的增加擴(kuò)增條帶數(shù)變化不明顯,但擴(kuò)增量逐漸減少；至Mg2+為5 mmol/L時(shí)未擴(kuò)增出譜帶。

圖2 Mg2+濃度對PCR擴(kuò)增的影響Fig.2 Effect of Mg2+ density on the amplification of PCR

2.2.2 dNTPs濃度優(yōu)化

圖3表明：當(dāng)dNTPs 為100 mmol/L時(shí),獲得譜帶少且模糊不清,隨著濃度增加,條帶數(shù)增加,且清晰度增強(qiáng),至dNTP的濃度為200 mmol/L時(shí)獲得達(dá)到最多,最清晰；而當(dāng)濃度進(jìn)一步升高時(shí),擴(kuò)增譜帶明顯變?nèi)?并且穩(wěn)定性降低。

圖3 dNTPs濃度對PCR擴(kuò)增的影響Fig.3 Effect of dNTPs density on the amplification of PCR

2.2.3 Taq DNA聚合酶用量優(yōu)化

由圖4可知,當(dāng)Taq DNA聚合酶為0.4 U時(shí),擴(kuò)增條帶數(shù)明顯少,且模糊不清；當(dāng)用量為0.6～1.6 U時(shí),譜帶數(shù)及亮度基本一致；當(dāng)Taq DNA聚合酶1.8～2.0 U比1.6 U增加一條譜帶,清晰度有所增加。由于反應(yīng)體系中 TaqDNA聚合酶的濃度過大時(shí)非特異性擴(kuò)增可能增多,濃度過低又可能導(dǎo)致合成新鏈的效率的下降,最終導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的減少,TaqDNA聚合酶的最佳用量為1.2 U即可。

圖4 Taq DNA聚合酶用量對PCR擴(kuò)增的影響Fig.4 Effect of Taq DNA polymerase on the amplification of PCR

由圖5結(jié)果表明：引物濃度的變化對反應(yīng)體系的影響較大,當(dāng)引物濃度為800和700 μmol/L時(shí),擴(kuò)增條帶較少且較弱,當(dāng)引物濃度降低至100 μmol/L時(shí),獲得條帶數(shù)量隨之增加且條帶清晰,增加多為250 bp以下的條帶,擴(kuò)增效果最好；當(dāng)引物濃度增加至為900 μmol/L條帶數(shù)和亮度也較700 μmol/L時(shí)增加,增加的多為1000 bp左右的大片段,但較密集。經(jīng)比較認(rèn)為引物的最佳濃度為100 μmol/L。

2.2.4 模板DNA用量

試驗(yàn)結(jié)果表明（圖6）,當(dāng)模板的用量為10～60 ng時(shí),均能擴(kuò)增出清晰的帶型,隨著模板DNA用量的增加,擴(kuò)增出譜帶數(shù)量基本一致,而譜帶的亮度逐漸增加。模板20 ng時(shí),譜帶的亮度適于各條譜帶的區(qū)分,并且能節(jié)省模板DNA的用量,確定為最佳模板用量,即20 μL反應(yīng)體系中的20 ng模板DNA。

圖6 模板DNA用量對PCR擴(kuò)增的影響Fig.6 Effect of use of template DNA on the amplification ofPCR

2.2.5 SRAP反應(yīng)體系的正交優(yōu)化

比較單因素篩選結(jié)果,選出正交試驗(yàn)各因子較好的4個(gè)水平,進(jìn)行正交試驗(yàn)體系優(yōu)化。結(jié)果如圖7所示,在16個(gè)正交組合中,各因素組合不同,擴(kuò)增結(jié)果明顯不同。16個(gè)處理均能擴(kuò)出譜帶,其中組合8的擴(kuò)增譜帶數(shù)量最多,最清晰。因此確定其為最佳反應(yīng)體系。即模板DNA 20 ng,Mg2+濃度2.0 mmol/L,dNTP濃度200 mmol/L,Taq酶0.8 U,引物濃度140 mmol/L,反應(yīng)總體積為20 μL。

圖7 正交設(shè)計(jì)擴(kuò)增的結(jié)果Fig.7 Results of amplified orthogonal design

對16個(gè)正交組合試驗(yàn)圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,K代表因子在某水平下獲得總條帶數(shù),k代表所對應(yīng)K值的平均值,R代表k的最大值與最小值之差,對比R值的大小以反映因子對擴(kuò)增結(jié)果的影響,即R越大影響越顯著[15]。由表3可知,Mg2+以2水平的2.0 mmol/L最好,dNTPs 以4水平的200 mmol/L最好,引物則以3水平的140 mmol/L最好,模板DNA用量以4水平的20 ng用量最好,Taq DNA 聚合酶以1水平的0.8 U最好。該數(shù)據(jù)剛好與通過圖譜觀察最佳組合8的結(jié)果一致。進(jìn)一步對比R大小,反應(yīng)體系中對擴(kuò)增結(jié)果的影響強(qiáng)弱順序?yàn)門aq DNA聚合酶＞引物 ＞ Mg2+＞ dNTPs= 模板 DNA。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析Tab.3 Analytical results of orthogonal experiments

3 結(jié)論與討論

在PCR反應(yīng)體系中各個(gè)因素間都會發(fā)生相互作用,如dNTPs會與Mg2+發(fā)生拮抗作用,Mg2+濃度又會對Taq DNA聚合酶的活性產(chǎn)生直接影響,而Taq DNA聚合酶在引物與模板DNA結(jié)合后的延伸中起重要作用[16]。因此,反應(yīng)體系中無論哪個(gè)因素發(fā)生改變都會導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果的變化。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增多態(tài)性位點(diǎn)及遺傳多樣性研究,易受到這些因素的影響,因此一個(gè)適宜的PCR反應(yīng)體系對于遺傳多樣性研究來說是尤為重要的。目前,PCR體系優(yōu)化的方法中以單因素法和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)用最為廣泛,其中單因素分析法直觀快速,但是忽略各因素間的互相作用[17],而正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)較好的避免了這一點(diǎn),但是正交試驗(yàn)的各因素水平范圍寬泛,缺乏確定各因素水平的標(biāo)準(zhǔn)。將單因素法與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合能夠彌補(bǔ)這些缺點(diǎn)。

初步篩選出13對SRAP引物可用于煙草靶斑病菌基因組的多態(tài)性分析；并結(jié)合了單因素與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對煙草靶斑病菌SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)化優(yōu)化,建立了適合該病菌的反應(yīng)體系：模板DNA 20 ng,Mg2+濃度2.0 mmol/L,dNTP濃度200 mmol/L,Taq酶0.8 U,引物濃度140 mmol/L,反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)體系中對擴(kuò)增結(jié)果的影響強(qiáng)弱順序?yàn)門aq DNA聚合酶＞引物＞ Mg2+＞ dNTPs=模板DNA。

[1]Li G, Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: Its application to mapping and gene tagging in Brassica [J].Theoretical and Applied Genetics, 2001,103(2/3): 455-461.

[2]柳李旺, 龔義勤, 黃浩, 等.新型分子標(biāo)記-SRAP與TRAP 及其應(yīng)用[J].遺傳, 2004, 26(5): 777-781.

[3]徐操, 趙寶華.SRAP 分子標(biāo)記的研究進(jìn)展及其應(yīng)用 [J].生命科學(xué)儀器, 2009, 7(4): 24-27.

[4]Ruiz J J, García-Martínez S, Picó B, et al.Genetic variability and relationship of closely related Spanish traditional cultivars of tomato as detected by SRAP and SSR markers [J].Journal of the American Society for Horticultural Science, 2005, 130(1): 88-94.

[5]Tang L H, Xiao Y, Li L, et al.Analysis of genetic diversity among Chinese Auricularia auricula cultivars using combined ISSR and SRAP markers [J].Current Microbiology, 2010, 61(2): 132-140.

[6]陳碧云, 胡瓊, Dixelius C, 等.利用 SRAP 分析核盤菌遺傳多樣性 [J].生物多樣性, 2010, 18(5): 509-515.

[7]王輝, 劉長遠(yuǎn), 趙奎華, 等.遼寧省辣椒疫病菌多態(tài)性及致病力分化研究初探 [J].微生物學(xué)通報(bào), 2012,39(2):180-190.

[8]Costa A S.Mancha aureolada erequeima do fumo causades por corticium solani [J].Biologicol, 1948,14:113-114.

[9]Vargas E.Infection by basidiospores ofThanatephoruscucumeriscausing a foliar disease in tobacco [J].Turrialba,1973, 23:357-359.

[10]Shew H D, Main C E.Rhizoctonialeaf spot of flue-cure tobacco in North Carolina [J].Plant disease, 1985, 69: 901-90.

[11]吳元華, 王左斌, 劉志恒,等.我國煙草新病害—靶斑病[J].中國煙草學(xué)報(bào), 2006, 12(6): 22-23.

[12]伏穎, 吳元華, 穆凌霄,等.煙草靶斑病菌基因組DNA提取及RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化 [J].煙草科技, 2011, 11:71-75,78.

[13]伏穎, 趙秀香,趙艷琴, 等.煙草靶斑病侵染特性研究 [J].中國煙草學(xué)報(bào), 2012, 18(5): 56-59.

[14]吳元華, 趙艷琴, 趙秀香,等.煙草靶斑病原鑒定及生物學(xué)特性研究 [J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,43(5):521-527.

[15]張麗, 周蘭英, 肖千文, 等.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在建立杜鵑花RAPD-PCR反應(yīng)體系中的應(yīng)用 [J].北方園藝,2007(5):124-126.

[16]任小巍, 王瑜, 袁慶華.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化草地早熟禾SRAP-PCR反應(yīng)體系及引物篩選 [J].草業(yè)科學(xué),2012(3):411-416.

[17]張平湖, 劉冠明.橄欖SRAP-PLR體系的建立和優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010,26(15):86-88.

Establishment and optimization of SRAP-PCR reaction system forRhizoctonia solanifrom tobacco target spot

ZHAO Yanqin1,2, WU Yuanhua1, ZHAO Xiuxiang1, AN Mengnan1, CHEN Jianguang1
1 College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China;
2 College of Agriculture, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao, 028043 China

SRAP primer pairs were screened for polymorphism using DNA ofRhizoctonia solaniisolates YC-9, LJT-8 and QYS-7 as templates.An orthogonal design of L16(45)was used to optimize SRAP-PCR reaction system forR.solaniof tobacco with 5 factors, namely Mg2+, dNTPs, primers, Taq DNA polymerase and template DNA.Results showed that a total of 13 polymorphic SRAP primer pairs were screened out of 100 SRAP primer pairs, and a suitable SRAP-PCR reaction system forRhizoctonia solanifrom tobacco target spot was 2.0 mmol.L-1 Mg2+, 200 mmol.L-1 dNTPs, 0.8U Taq DNA polymerase, 140 mmol.L-1 primer pairs, 20 ng template DNA and 1×PCR buffer.In addition, each factor in SRAP-PCR reaction system had different effects on amplified patterns in descending order of Taq DNA polymerase＞ primer＞Mg2+＞ dNTPs=DNA.

Rhizoctonia solanifrom tobacco target spot; orthogonal experiment design; optimization of reaction system; primer screening

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.016

S432.41; Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）03-0096-06

國家煙草專賣局科技攻關(guān)項(xiàng)目 [國煙辦綜 (2010)182號]；遼寧省煙草專賣局科技攻關(guān)項(xiàng)目[遼煙計(jì)（2010）86號]

趙艷琴(1978—),博士研究生,植物病原真菌學(xué),Email：zhaoyanqin782828@qq.com

吳元華（1963—）,博士,教授,植物病理學(xué)及生物農(nóng)藥,Email：wuyh09@vip.sina.com

2013-04-23