楊惠娟，王景，許俐，劉國(guó)順，史宏志

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 /國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地/ 煙草行業(yè)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州文化路95號(hào),450002

生物技術(shù)

烤煙營(yíng)養(yǎng)生殖轉(zhuǎn)換期葉片生長(zhǎng)標(biāo)志蛋白的篩選

楊惠娟，王景，許俐，劉國(guó)順，史宏志

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院 /國(guó)家煙草栽培生理生化研究基地/ 煙草行業(yè)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州文化路95號(hào),450002

通過(guò)雙向電泳的方法對(duì)烤煙營(yíng)養(yǎng)、生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換時(shí)期葉片的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行比較研究,鑒定出在兩個(gè)時(shí)期葉片中差異表達(dá)的8個(gè)標(biāo)志蛋白。其中有6個(gè)蛋白在烤煙營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中表達(dá)量較高,分別是與光合相關(guān)的葉綠體放氧復(fù)合蛋白（chloroplast oxygen-evolving complex/thylakoid luminal 25.6kDa protein）,光呼吸過(guò)程中的關(guān)鍵酶絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶1（SHM1,Serine transhydroxymethyltransferase 1）,與蛋白質(zhì)合成及植物生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分裂有關(guān)的核糖體60S與30S蛋白,谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST,glutathione S-transferase）和葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET,xyloglucan endotransglycosylase ）。另外2個(gè)碳同化過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶Rubisco大亞基（Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/ oxygenase large subunit）和小亞基（Small subunit ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase）則在烤煙生殖生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中表達(dá)量較高。結(jié)果表明烤煙在營(yíng)養(yǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換過(guò)程中葉片通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵途徑的蛋白表達(dá)以降低葉片的呼吸作用、蛋白質(zhì)合成過(guò)程及抗氧化能力,同時(shí)增強(qiáng)葉片的碳同化過(guò)程。

烤煙 ；營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)； 生殖生長(zhǎng)；蛋白質(zhì)組

植物從種子發(fā)芽到根、莖、葉的生長(zhǎng),花序分化,開花結(jié)實(shí)要經(jīng)過(guò)外部形態(tài)、內(nèi)部構(gòu)造的一系列復(fù)雜生理生化的變化過(guò)程。其中,營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的一個(gè)重要階段。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)變意味著植物的生長(zhǎng)逐漸進(jìn)入成熟時(shí)期,而植物的內(nèi)在生理變化是主導(dǎo)植物生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)變的主要因素[1]。自然界大部分開花植物都是先形成葉這樣的營(yíng)養(yǎng)器官,然后在一定階段頂端分生組織從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化成生殖生長(zhǎng),從而產(chǎn)生花及生殖器官[2]。營(yíng)養(yǎng)、生殖轉(zhuǎn)換時(shí)期是植物體內(nèi)各生理過(guò)程發(fā)生重要變化的時(shí)期,這兩個(gè)時(shí)期的植物生理狀態(tài)與生長(zhǎng)方向有著極大的不同。開花是植物整體進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)期的標(biāo)志,在這一過(guò)程中植物頂端分生組織從細(xì)胞內(nèi)部的代謝途徑到外部表型都會(huì)發(fā)生一系列程序化的變化,與開花相關(guān)的基因的表達(dá)是實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ), 環(huán)境因子如春化作用和光周期以及細(xì)胞自身的生長(zhǎng)狀況對(duì)這些基因的表達(dá)都起著調(diào)控作用。有研究結(jié)果表明外界因子誘導(dǎo)植物開花的接受器官是葉,葉片在感知外界變化后通過(guò)產(chǎn)生信號(hào)物質(zhì)傳遞給頂端分生組織然后導(dǎo)致植物開花,該結(jié)果表明葉在植物營(yíng)養(yǎng)、生殖生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)生了顯著的內(nèi)在變化,從而對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)生殖生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)變起了重要的作用[3]。

在生產(chǎn)中通過(guò)打頂措施來(lái)適當(dāng)延長(zhǎng)和增強(qiáng)烤煙的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)同時(shí)控制煙株的生殖生長(zhǎng),以獲得優(yōu)質(zhì)的烤煙葉片。因此,研究烤煙在營(yíng)養(yǎng)生殖轉(zhuǎn)換時(shí)期葉片的生理變化特征及其內(nèi)在變化機(jī)制,對(duì)于控制烤煙葉片生長(zhǎng)狀態(tài)有著積極的意義。本文以研究烤煙在營(yíng)養(yǎng)與生殖轉(zhuǎn)換過(guò)程中的關(guān)鍵響應(yīng)蛋白為目的,旨在了解在烤煙營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換期葉片中主要差異表達(dá)的蛋白,并對(duì)相關(guān)蛋白的功能和作用進(jìn)行了探討。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)置

供試煙草品種為K326,試驗(yàn)地點(diǎn)為河南省平頂山市郟縣。于2010年3月4日播種育苗, 5月11日移栽,種植管理方法均按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)進(jìn)行。移栽后50 d（烤煙以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主）和60 d（烤煙以生殖生長(zhǎng)為主）時(shí)取中部第12葉位葉片,液氮冷凍置-80℃冰箱保存。

1.2 蛋白樣品的制備

葉片蛋白樣品提取采用植物蛋白微量提取試劑盒(Tiands, Inc, China)。蛋白提取物溶于200 μL緩沖液（8 M尿素,2 M硫脲,4% (v/v) CHAPS,2% (v/v) IPG緩沖液(pH3-10)和30 mM DTT）。混合液室溫下放置10 min后,4 ℃冰浴超聲降解2 min,再經(jīng)15000 g、15 min離心兩次,取上清液-80 ℃冰箱保存。

1.3 雙向電泳分離和圖譜分析

第一向?yàn)榈鞍讟悠返牡入娋劢?操作方法參照IPGphor等電聚焦系統(tǒng)(Amersham Biosciences)。上樣量為80 μg的蛋白樣品,于500 μl的上樣緩沖液中溶解,所用膠條為24 cm電解質(zhì)膠條（pH 3-10, Liner,Amersham Biosciences）。上樣緩沖液成分包括8.0 M尿素, 2% (w/v) CHAPS, 30 mM DTT, 0.5% (v/v) IPG緩沖液(pH 3-10), 和 0.002% (w/v) 溴酚藍(lán)。等電聚焦程序設(shè)置為：30 V,12 h；200 V,500 V,2000 V,4000 V,各1 h；8000 V,11 h；程序總共為95060 Vh。聚焦結(jié)束后將IEF膠條放入平衡緩沖液Ⅰ中孵育15 min,組分為6 M Urea, 30% glycerol, 2% SDS,0.05 M Tris pH 8.8,1% DTT,之后再將膠條轉(zhuǎn)入平衡緩沖液中Ⅱ中孵育15 min,其組分為6 M Urea, 30%glycerol, 2% SDS, 0.05 M Tris Ph 8.8 ,2.5 % 碘乙酰胺。經(jīng)2次平衡后將膠條轉(zhuǎn)移至14.5%聚丙烯酰胺SDS分離膠上進(jìn)行第二向蛋白質(zhì)凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳于15℃進(jìn)行（Ettan DALT six electrophoresis unit,Amersham Biosciences）。結(jié)束以銀染法進(jìn)行染色,凝膠經(jīng)高清晰度圖像掃描儀(PowerLook 2100xl-USB,UMAX)掃描。每個(gè)樣品重復(fù)3次,所得蛋白表達(dá)圖譜用ImageMaster 2D Platinum 6.5.軟件分析。蛋白質(zhì)點(diǎn)的Ratio（打頂后/打頂前）值大于1.50或者低于0.67的蛋白質(zhì)點(diǎn)為差異表達(dá)蛋白。

1.4 膠內(nèi)酶解和蛋白鑒定

將差異表達(dá)蛋白點(diǎn)從凝膠中割下,放入褪色液（30 mmol/L K3Fe(CN)6,100 mmol/L Na2S2O3以1:1 體積比配制）中褪色。經(jīng)milli-Q水洗滌后,浸入200mmol/L碳酸胺平衡緩沖液中平衡20 min,再以milli-Q水洗兩遍。經(jīng)乙腈脫水后,于真空離心蒸發(fā)器(Thermo Savant, USA)中干燥30 min,加入5 μL的胰島素于4 ℃水化40 min（sequencing grade;Promega, Madison, WI, USA）,37 ℃溫育過(guò)夜或者大于20 h,最后加入100 μL 的0.1 %三氟醋酸和 60%乙腈的混合液浸提15 min以萃取樣品,經(jīng)真空離心蒸發(fā)器干燥后,再溶解于1.5 μL,0.1%的三氟醋酸中備用。

將獲得的肽段與溶解于0.1% TFA,50% CAN溶液中、濃度為5 mg/mL的α-氰基-4-對(duì)羥基桂皮酸(HCCA , Sigma, St.Louis, MO, USA)等體積混合,將樣品溶液點(diǎn)至點(diǎn)樣板后,于室溫干燥。蛋白質(zhì)鑒定所用質(zhì)譜儀為4800 MALDI-TOF/TOF(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)。運(yùn)用GPS ExplorerTM software Version 3.6 (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA)和MASCOT搜索引擎（Version 2.2; Matrix Science, London, UK）對(duì)蛋白和肽段進(jìn)行鑒定。查詢參數(shù)為NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù),綠色植物種屬,胰蛋白酶消化,MS（一級(jí)質(zhì)譜）和MS/MS（二級(jí)質(zhì)譜）最大容許誤差范圍為100×10-6,肽片段分子量最大容許誤差范圍為± 0.8 Da。經(jīng)MS/MS質(zhì)譜查詢,置信區(qū)間＞ 95%的結(jié)果為蛋白鑒定的最終信息。

1.5 總RNA的提取及cDNA的合成

RNA的提?。喝〖s0.1 g的煙草葉片組織在液氮中研磨成粉末狀,加入1 mL的Trizol（Invitrogen,USA）于冰上研磨約10 min,轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中。室溫靜置5 min后加入0.2 mL氯仿,劇烈震蕩30 s,室溫孵育3 min,10000×g于4 ℃離心15 min,轉(zhuǎn)移上層水相于一新離心管中,加入500 μL異丙醇,室溫沉淀10 min,12000×g離心棄上清,沉淀用75%的乙醇清洗后溶于30～50 μL的無(wú)菌水備用。取約1 μg的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反轉(zhuǎn)錄所用試劑為M-MLV Reverse Transcriptase（LifeFeng,China）。逆轉(zhuǎn)錄的cDNA于-20 ℃冰箱保存。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

反應(yīng)采用20 μLPCR體系：10 μL SYBR Premix（2×）、5.2 μL無(wú)菌水、1 μL cDNA、各0.4 μL（10 mM）的熒光定量上、下游引物。以18s基因?yàn)閷?duì)照基因,分別對(duì)內(nèi)參基因18s和目的基因Rubisco大亞基(l-rub)、小亞基(s-rub)特異引物進(jìn)行熒光定量PCR（Eppendorf, Germany）擴(kuò)增,得到Cycle Threshold（CT）值,利用SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平（Mastercycler realplex2,Eppendorf, Germany）,操作步驟參照SYBR Premix Ex TagTm（TaKaRa, Japan）說(shuō)明書進(jìn)行。引物序列為 18s F：5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’,18s R：5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3； s-rub F: 5’-TCTTACACGTGGCACCTCCA-3,s-rub R:5’- CAACAACCCCCTCATCTTGG -3’; l-rub F:5’-GCACAGGCTGAAACAGGTGA -3,l-rub R: 5’-CGGAACGCCCAATTCTCTAG -3’。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 30 s,94 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40個(gè)循環(huán)反應(yīng),溶解曲線程序?yàn)?95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。操作步驟參照SYBR Premix Ex TagTm (TaKaRa, Bio.,Inc., Japan)說(shuō)明書進(jìn)行。每個(gè)樣品反應(yīng)設(shè)3次重復(fù),通過(guò)2ˉ△△CT方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（CT,Cycle Threshold）。

2 結(jié)果

2.1 烤煙營(yíng)養(yǎng)生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換時(shí)期葉片差異蛋白的篩選

通過(guò)對(duì)烤煙移栽后50 d(營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主)的與移栽后60 d（生殖生長(zhǎng)為主）葉片的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析,共有8個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)相對(duì)豐度比值（ratio）大于1.5或是小于0.67（圖1,圖2,表1）。其中有6個(gè)蛋白質(zhì)是在葉片營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)量較高,而另外2個(gè)蛋白質(zhì)則在生殖生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)量較高。

圖1 煙草葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜Fig.1 2-dimensional electrophoresis pattern of the proteins in tobacco leaf

圖2 烤煙營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換時(shí)期葉片差異蛋白質(zhì)點(diǎn)Fig.2 Detailed spots images of successfully identified differentially expressed proteins between the two growth stages

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定

通過(guò)質(zhì)譜和生物信息學(xué)鑒定和分析, 8個(gè)差異表達(dá)蛋白的詳細(xì)信息如表1所示。6個(gè)在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期高表達(dá)的蛋白分別是：葉片光合相關(guān)的葉綠體放氧復(fù)合蛋白（chloroppast oxygen-evolving complex/thylakoid luminal 25.6 kDa protein）、光呼吸過(guò)程中的關(guān)鍵酶絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶1（SHM1,Serine hydroxyl transferase 1）、與蛋白質(zhì)合成及植物生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分裂有關(guān)的核糖體60S與30S蛋白、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST,Glutathione S-transferase）和葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET,Xyloglucan endotransglycosylase ）。2個(gè)在生殖生長(zhǎng)時(shí)期葉片中高表達(dá)的蛋白是碳同化過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白R(shí)ubisco大亞基（Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/ oxygenase large subunit） 和 Rubisco小 亞 基（Small subunit ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase）。

2.3 烤煙營(yíng)養(yǎng)生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換期葉片Rubisco大亞基與小亞基的mRNA的表達(dá)量

在鑒定的8個(gè)差異蛋白中,在生殖生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中Rubisco大亞基與小亞基表達(dá)量較高。為了驗(yàn)證其在mRNA水平上的積累量,用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)Rubisco大亞基與小亞基蛋白的mRNA進(jìn)行了檢測(cè)（表2,表3）。結(jié)果表明營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期葉片中Rubisco大亞基在mRNA水平表達(dá)量是生殖生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量的0.4倍, Rubisco小亞基在兩個(gè)時(shí)期的表達(dá)量幾乎相當(dāng)。

3 討論

在營(yíng)養(yǎng)生殖轉(zhuǎn)換時(shí)期植物的各個(gè)器官均發(fā)生了重要的生理變化。有文獻(xiàn)報(bào)道,葉片是感知外界因素誘導(dǎo)開花的主要器官,說(shuō)明葉片的生理變化在植株生育發(fā)育轉(zhuǎn)變過(guò)程中起了關(guān)鍵的作用。

我們通過(guò)對(duì)烤煙營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、生殖生長(zhǎng)關(guān)鍵轉(zhuǎn)換期的葉片的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析研究,鑒定出8個(gè)在該轉(zhuǎn)換期差異表達(dá)的蛋白。其中6個(gè)在以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主的葉片中高表達(dá)的蛋白是葉綠體放氧復(fù)合蛋白、SHM1、核糖體60S與30S蛋白、GST、和XET。

葉綠體放氧復(fù)合蛋白與SHM1與植物的光合和光呼吸過(guò)程有關(guān)。葉綠體放氧復(fù)合蛋白屬于葉綠體類囊體腔蛋白,葉綠體蛋白與葉片的光合功能有密切的關(guān)系,類囊體是葉綠體的關(guān)鍵組成部分,是葉綠體光反應(yīng)過(guò)程中氧化水分子釋放出氧氣所不可缺少的酶類[6]。SHM1屬于絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶SHMT中的一種,它的主要生理學(xué)功能是催化絲氨酸和甘氨酸之間可逆的互換,在高等植物的光呼吸中起著非常重要的作用[7]。如果植物缺少SHMT,通常會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)延遲。SHM1編碼的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶參與植物的光呼吸過(guò)程,在轉(zhuǎn)錄豐度上有周期性,在葉片中的表達(dá)和積累受光的強(qiáng)烈誘導(dǎo)[8-10]。也有研究表明蘋果樹中的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（SHMT）只在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期明顯大量表,在生殖生長(zhǎng)時(shí)期不表達(dá)[11]。植物的呼吸作用在植物的各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期也會(huì)發(fā)生變化,如紅杉中的呼吸速率在在幼年期較強(qiáng),但在成熟期則變?nèi)鮗12]。研究表明在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)兩個(gè)時(shí)期中,與植物光呼吸相關(guān)的一些生理過(guò)程在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期作用較強(qiáng)。我們的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)葉綠體放氧復(fù)合蛋白與SHM1這兩種與光呼吸作用相關(guān)的酶在烤煙營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中積累較多,而在生殖生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中積累降低,表明處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的葉片具有較強(qiáng)的光合反應(yīng)能力,也具有較強(qiáng)的光呼吸能力,葉片的這一生理特征可以在煙株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期為植株提供充足的光合產(chǎn)物,為植物的快速生長(zhǎng)提供條件。伴隨著旺盛、活躍的生長(zhǎng)代謝過(guò)程,葉片也具有較強(qiáng)的光呼吸過(guò)程,也將消耗掉一部分的能量物質(zhì)。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段呼吸速率的增強(qiáng)反映出植物為了適應(yīng)此階段旺盛的代謝過(guò)程而需要大量的能量。所以,葉綠體放氧復(fù)合蛋白與SHM1可以很好的表征葉片的光合與呼吸生理過(guò)程。

60S 核糖體蛋白L12-3 與30S核糖體蛋白S10在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期也有較高的積累,核糖體蛋白的功能除組成核糖體、參與蛋白質(zhì)生物合之外還參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄加工、翻譯調(diào)控、DNA修復(fù)、自體翻譯、細(xì)胞凋亡調(diào)控、正常細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)育調(diào)控過(guò)程[13-15]。在植物體內(nèi),核糖體基因的突變會(huì)影響植物體的胚胎發(fā)育及生長(zhǎng)發(fā)育[16-19]。有研究表明在細(xì)胞分裂期[19-21],激素處理的胚軸、分生組織的頂端、幼葉及側(cè)根中核糖體基因表達(dá)均較高[22-23],說(shuō)明生長(zhǎng)迅速、代謝旺盛的組織和生長(zhǎng)時(shí)期核糖體蛋白表達(dá)量都會(huì)有所升高。我們的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)60S 核糖體蛋白L12-3 與30S核糖體蛋白S10在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中的表達(dá)量比生殖生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量高,表征營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的葉片生長(zhǎng)及蛋白合成相對(duì)處于較旺盛的時(shí)期,而生殖生長(zhǎng)時(shí)期的葉片相對(duì)較弱,也表明在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖轉(zhuǎn)換的時(shí)期葉片的生長(zhǎng)及蛋白合成功能會(huì)受到抑制。

葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶XET與植物的細(xì)胞壁的修飾有關(guān)。它在植物細(xì)胞分化、 擴(kuò)展和細(xì)胞特化等多方面起重要作用,有學(xué)者認(rèn)為它可能是植物生長(zhǎng)機(jī)制中的核心酶[22]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝和抗逆反應(yīng)中有重要作用。它也受生長(zhǎng)素、乙烯等植物激素的誘導(dǎo)表達(dá),與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[25]。GST屬于抗氧化酶類,具有抵抗衰老,清除自由基、維持和保護(hù)正常的機(jī)體生理功能的作用。XET與GST這兩種酶在植物中均能起到促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用,提高葉片抗氧化和抗衰老的能力。XET與GST這兩種酶蛋白在烤煙營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中表達(dá)量較高也說(shuō)明在烤煙的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段,葉片出于生長(zhǎng)的旺盛期,其組織細(xì)胞壁的擴(kuò)展速度與細(xì)胞的抗氧化能力都較強(qiáng)。與此相反,在烤煙的生殖生長(zhǎng)時(shí)期,葉片的擴(kuò)展已逐漸停止,并進(jìn)入衰老生長(zhǎng),其抗氧化能力也將逐漸降低

在烤煙以生殖生長(zhǎng)為的生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中,Rubisco大亞基和小亞基兩個(gè)蛋白的積累量較高。Rubisco是光合碳同化作用的關(guān)鍵酶[26]。同時(shí)也參與植物的光呼吸代謝途徑,消耗植物光合作用合成的有機(jī)物[27]。Rubisco一般由多個(gè)大亞基(LSU) 和小亞基(SSU) 組成[28]。大亞基具有催化功能,小亞基具有調(diào)節(jié)作用。小亞基能促進(jìn) CO2, 與Mg2＋對(duì)酶的活化,維持和穩(wěn)定酶的活化構(gòu)象,小亞基可能在進(jìn)化過(guò)程中起了聚集大亞基活性位點(diǎn)的角色,小亞基可能有更多特異性功能[29]。在植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)兩個(gè)階段中,植物體內(nèi)某些與光合作用相關(guān)的酶會(huì)發(fā)生變化,有研究表明RuBisco在常春藤葉柄中的表達(dá)量在營(yíng)養(yǎng)階段和生殖階段具有明顯差異[30-31]。Rubisco對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用,與氮的吸收、利用及循環(huán)也有密切關(guān)系。烤煙在進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)期后,需要消耗大量的同化產(chǎn)物和能量物質(zhì)用于以開花為主的生殖生長(zhǎng)。 Rubisco大、小亞基蛋白在生殖生長(zhǎng)時(shí)期的烤煙葉片中積累量較高表明該時(shí)期的葉片碳同化生理過(guò)程也較強(qiáng),有利于合成較多的同化產(chǎn)物,以滿足生殖生長(zhǎng)時(shí)期大量的能量消耗。本研究還對(duì)Rubisco大、小亞基蛋白在烤煙營(yíng)養(yǎng)生殖轉(zhuǎn)換時(shí)期葉片中的mRNA積累量進(jìn)行了研究。在烤煙營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中表達(dá)量也是較低,僅為生殖生長(zhǎng)時(shí)期的0.4倍和 1.06倍,該結(jié)果在mRNA水平也證實(shí)Rubisco大、小亞基在烤煙生殖生長(zhǎng)時(shí)期的葉片中表達(dá)量較高。生殖生長(zhǎng)時(shí)期的烤煙葉片Rubisco大、小亞基可以作為標(biāo)志蛋白表征葉片的碳同化功能與葉片營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換期的標(biāo)志蛋白。

4 結(jié)論

本研究篩選出烤煙營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期向生殖生長(zhǎng)時(shí)期轉(zhuǎn)化過(guò)程中葉片表達(dá)具有明顯差異的8個(gè)標(biāo)志蛋白。結(jié)果提示我們?cè)诳緹熞誀I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)為主的時(shí)期,葉片處于快速生長(zhǎng)期,代謝旺盛,有較強(qiáng)的蛋白合成和呼吸作用以及抗氧化能力,而在以生殖生長(zhǎng)為主的時(shí)期,植物則需要較高的碳同化酶來(lái)為積累較多的光合產(chǎn)物為隨后大量消耗能量的生殖生長(zhǎng)提供條件,從而完成從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換。

表1 差異點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果以及信息學(xué)分析Tab. 1 List of the differentially expressed proteins successfully identified by MALDI-TOF/TOF

表2 50 d、60d Rubisco大亞基l-rub的mRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab.2 The relative mRNA expression level of Rubisco large subunit (l-rub) in leaves 50 days after transplanting compared with that 60 days after transplanting

表3 移栽后50 d、60d Rubisco小亞基s-rub的mRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab.3 The relative mRNA expression level of Rubisco small subunit (s-rub) in leaves 50 days after transplanting compared with that 60 days after transplanting

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Screening of leaf protein marker during transformation from vegetative growth stage to reproductive stage in flue-cured tobacco

YANG Huijuan , WANG Jing , XU Li ,LIU Guoshun , SHI Hongzhi
College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Key Laboratory of National Tobacco Cultivation, Zhengzhou 450002, China

A comparative study was conducted on protein expression profiling of leaf blade during transformation from vegetative growth stage to reproductive stage in flue-cured tobacco through 2-D electrophoresis, which identified 8 differentially expressed leave protein markers.Among them 6 proteins related to photo-respiratory, protein synthesis and cell development which are chloroplast oxygen-evolving complex/thylakoid luminal 25.6kDa protein, SHM1 (Serine transhydroxymethyltransferase 1), 60S ribosomal protein and 30S ribosomal protein, GST (glutathione S-transferase) and XET (xyloglucan endotransglycosylase) were shown to be highly expressed in vegetative grown leaves.Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase large subunit and small subunit ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase which are key enzymes related to carbon fixation were found to have a relative high expression level in reproductive grown leaves.The main differentially expressed proteins between these two stages in tobacco leaves showed that during transformation from vegetative growth stage to reproductive stage the photo-respiratory, protein synthesis and anti-oxidation physiology functions decreased while carbon fixation ability were strengthened through the regulation of expression of related proteins.

flue-cured tobacco; vegetative growth stage; reproductivestage；proteome

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.015

S572.01; Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1004-5708（2014）03-0089-07

河南省教育廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2013A180474）,國(guó)家煙草專賣局特色煙重大專項(xiàng) (No.110201101001)

楊惠娟 (1978—),女,副教授,從事煙草生物技術(shù)研究,Email: huijuanyang@henau.edu.cn

史宏志 (1963—),教授,從事煙草栽培生理研究,Email: shihongzhi88@163.com

2013-04-08