劉柏含，高艷霞，王占義＊，姬朝光，宮培剛

（1.長春市口腔醫(yī)院 頜面外科，吉林 長春130051；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021）

眾所周知，胰島素樣生長因子－1（insulinlike growth factor－1，IGF－1）是一種重要的調(diào)控因子，因其結(jié)構(gòu)與胰島素相類似而得名[1，2]。目前，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是直接作用于血管內(nèi)皮而且作用最強(qiáng)的生長因子，F(xiàn)rerich B等[3]利用IGF－1和 VEGF成功構(gòu)建組織工程人工血管，發(fā)現(xiàn)兩種生長因子聯(lián)用可以獲得更好的結(jié)果，同時發(fā)現(xiàn)IGF－1可以有效的促進(jìn)多種細(xì)胞分泌VEGF，通過增強(qiáng)血管的穩(wěn)定性從而促進(jìn)血管生成和新骨形成，然而，IGF－1如何誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的機(jī)制仍在探索中。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）為研究對象，外源性地加入IGF－1后檢測細(xì)胞中 VEGF、HIF－1α和p－MEK 等相關(guān)信號蛋白的表達(dá)，同時加入MNK抑制劑CGP 57380和HIF－1α抑制劑YC－1后再檢測含外源性IGF－1的細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，從而為探討IGF－1誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 6個月齡雄性新西蘭大白兔，購自吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 試劑 L－BMSCs（GIBCO BRL，USA）、胎牛血清（GIBCO公司，USA）、Percoll細(xì)胞分離液（Pharmacia，Biotec，USA） 、抗 CD29、CD44、VEGF、HIF－1α 和 p－MNK 單 抗 （Santa Cruz Biotech，USA），HRP－羊抗兔IgG購于鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓間充質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）分離與培養(yǎng) 取新西蘭大白兔3%戊巴比妥鈉（30mg／1ml／kg）耳緣靜脈緩慢注射麻醉，無菌下暴露雙側(cè)股骨，牙科鉆鉆孔，用含有0.1ml肝素的10ml注射器負(fù)壓吸取骨髓血2－5ml與等量L－BMSCs混合，800rpm／min，離心8min；棄上清，制成細(xì)胞懸液；再將細(xì)胞懸液輕輕加到離心管內(nèi)的Percoll淋巴細(xì)胞分離液面上2 500rpm／min，離心30min，抽取培養(yǎng)液與分離液液面之間的單個核細(xì)胞層細(xì)胞，加入L－BMSCs沖洗，1 000r／min，離心8min，反復(fù)兩次；用含10%胎牛血清的重懸細(xì)胞并計數(shù)，調(diào)細(xì)胞濃度為5×106個細(xì)胞／ml，接種于50ml塑料培養(yǎng)瓶中，每瓶接種3ml。將細(xì)胞置于37℃下5%CO2、95%濕度孵箱中培養(yǎng)，接種1天后半量換液，其后每2天換液1次。待細(xì)胞80%～90%融合時，棄去培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶，37℃消化細(xì)胞。吸取細(xì)胞懸液離心洗滌，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以1∶2在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，此為第1代細(xì)胞。同上方法，細(xì)胞依次傳代為第2代、第3代，直至第5代。

1.2.2 細(xì)胞鑒定 取培養(yǎng)的5代細(xì)胞，消化制成密度為1.0×106／mL的單細(xì)胞懸液，接種到含有蓋片的6孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，每孔接種細(xì)胞2ml，37℃下5%CO2孵箱培養(yǎng)過夜。取出蓋片，用PBS洗3次，加入CD29單克隆抗體，室溫下孵育60min；用PBST洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，繼續(xù)孵育60min，用PBST洗3次，加底物顯色后，顯微鏡下觀察，記錄結(jié)果。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分4組進(jìn)行：取第5代細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，同樣濃度接種4瓶，培養(yǎng)4h后，按下列分組加入培養(yǎng)液，進(jìn)行條件培養(yǎng)。

①每瓶加3ml含3%FCS的BMSCs溶液培養(yǎng)；

②每瓶加3ml含50ng／ml的IGF－1和3%小牛血清的BMSCs培養(yǎng)液；

③每瓶加3ml含5ng／ml CGP 57380、50ng／ml的IGF－1和3%小牛血清的BMSCs培養(yǎng)液；

④每瓶加3ml含5ng／ml YC－1、50ng／ml的IGF－1和3%小牛血清的BMSCs培養(yǎng)液。

條件培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞用于免疫印跡分析。

1.2.4 免疫印跡分析

1.2.4.1 樣品制備 將條件培養(yǎng)的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)上清，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。每孔加入含各種蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液1ml，于冰上裂解15min。裂解完后，將裂解液和細(xì)胞碎片移至1.5 ml離心管中。用超聲裂解儀5KHz，每次裂解1－2 s，重復(fù)10次。4℃下，1 2000rpm／min，離心30 min。將離心所得上清轉(zhuǎn)移至新的1ml的離心管中。采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，加入等體積2×上樣緩沖液后沸水浴煮蛋白10min，用于免疫印跡分析。

1.2.4.2 免疫印跡 將條件培養(yǎng)的細(xì)胞裂解液經(jīng)SDS－PAGE垂直板電泳對蛋白進(jìn)行分離、采用半干燥轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上、再通過用5%脫脂奶粉封閉、先后分別與第一抗體（β－Actin、VEGF、HIF－1α和p－MNK）、二抗孵育后，加ECL試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄結(jié)果。

2 結(jié)果分析

2.1 BMSCs分離、培養(yǎng)與鑒定

本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第5代時，BMSCs呈梭型、漩渦狀貼壁生長。其表面標(biāo)志物CD29、CD44的免疫組化染色顯示細(xì)胞純度在90%以上，見圖1。

圖1 BMSCs的免疫組化鑒定

2.2 條件培養(yǎng)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路相關(guān)分子的免疫印跡分析

IGF－1下游 MAPK信號通路相關(guān)分子及VEGF的表達(dá)免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)，其上游的 HIF－1α及MAPK相關(guān)的兩個信號蛋白表達(dá)明顯增高，如圖2。加入CGP 57380和YC－1后，VEGF表達(dá)減弱，外源性IGF－1的作用減弱，如圖3。

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類來源于中胚層的具有強(qiáng)大多向分化潛能的成體干細(xì)胞，因?yàn)椴皇軅惱硐拗瓶梢宰泽w移植并可以成骨、成脂、成神經(jīng)向組織分化而被視為移植首選種子細(xì)胞[4－9]。BMSCs在骨髓中含量極低，僅占骨髓有核細(xì)胞的0.001%，且隨著年齡增大數(shù)量逐漸減少，因此，獲得相當(dāng)數(shù)量的高純度的BMSCs是科學(xué)研究和臨床治療的應(yīng)用基礎(chǔ)[10]。

圖2 條件培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)VEGF、HIF－1α、p－MNK表達(dá)的免疫印跡分析

圖3 條件培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)的免疫印跡分析

IGF－1與VEGF的協(xié)同作用關(guān)系早有研究。Slomiany MG[11]通過向體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系中加入不同劑量的IGF－1發(fā)現(xiàn) HIF－1表達(dá)劑量依賴性增加，VEGF也相應(yīng)增加。Smith LE的研究表明，VEGF介導(dǎo)了IGF－1的新血管生成作用，IGF－1受體拮抗劑抑制VEGF的同時抑制視網(wǎng)膜新血管的形成[12]。Ryo Fukuda等[13]發(fā)現(xiàn)IGF－1能夠通過PI3K－AKT和MAPK兩條通路誘導(dǎo)HIF－1介導(dǎo)的VEGF的表達(dá)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)外源性上調(diào)p－ERK和p－MNK的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)了VEGF的表達(dá)上調(diào)，用CGP 57380和YC－1分別阻斷p－MNK和 HIF－1α的作用后，外源性IGF－1誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)上調(diào)的效應(yīng)減弱，這暗示IGF－1通過ERK－MNK信號通路誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，但是并不意味著IGF－1與VEGF劑量與時間水平越高越好。多種腫瘤細(xì)胞中IGF－1與VE協(xié)同作用GF水平高于正常，例如和IGF－1和VEGF的雙重抑制會有效抑制卵巢癌生長[14]。最近的一項(xiàng)研究表明：IGF－1可以抗氧化應(yīng)激[15]。

綜上，尋找IGF－1信號通路相關(guān)蛋白并確定其特異性調(diào)節(jié)靶點(diǎn)更有益于相關(guān)疾病治療。

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