曲志娜，胡學(xué)遠(yuǎn)，王 娟，趙思俊，李玉清，黃秀梅，劉煥奇，王君瑋

(1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109)

禽致病性大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)不僅能引發(fā)禽大腸桿菌病，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展，也與人類腸外致病性大腸桿菌密切相關(guān)，是毒力基因的貯存宿主，可引發(fā)人類食源性疾病。該病的發(fā)生不僅與環(huán)境衛(wèi)生差、機(jī)體免疫力低下等有關(guān)，也與禽致病性大腸桿菌的致病性、耐藥性以及二者的傳播密切相關(guān)。耐藥性和致病性的結(jié)合可造成該類細(xì)菌引發(fā)的疾病更加難以預(yù)防和治療，且隨著抗菌藥的廣泛使用和盲目濫用，導(dǎo)致臨床菌株耐藥更加嚴(yán)重，同時(shí)加強(qiáng)了抗菌藥物在畜禽體內(nèi)的殘留，而且其攜帶的耐藥基因可隨著食物鏈間接對(duì)公眾健康造成影響，給我國(guó)畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展和人類的身體健康帶來(lái)潛在危害。

本研究采用PCR法對(duì)不同省區(qū)雞源大腸桿菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化群分析，通過(guò)致病性試驗(yàn)，了解雞源大腸桿菌致病菌株的分布情況，結(jié)合耐藥性檢測(cè)結(jié)果，分析不同地區(qū)間及致病菌群與低/非致病菌群之間的耐藥差異，為臨床合理用藥和細(xì)菌性疾病的防治提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 438株雞源大腸桿菌(山東167株，河南50株，安徽50株，山西42株，內(nèi)蒙59株，重慶60株，從表觀健康雞的泄殖腔拭子分離獲得)，以及O2標(biāo)準(zhǔn)菌株，均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心動(dòng)物產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)室提供。大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑和儀器 胰蛋白胨大豆肉湯、LB肉湯、Mueller-Hinton肉湯(MHB)、細(xì)菌瓊脂粉均購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)有限公司;96孔藥敏板，購(gòu)自天津市金章科技發(fā)展有限公司;GoTaqGreen Master Mix、DNA Marker DL2000和瓊脂糖購(gòu)自TaKaRa公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海愛(ài)朗儀器有限公司EYELS SLI-700型)、快速渦勻器(中外合資深圳天南海北有限責(zé)任公司SK-1)、PCR儀(BIORAD公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)和Gel Doc XR凝膠成像分系統(tǒng)(BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 系統(tǒng)進(jìn)化群分群試驗(yàn) 采用PCR法檢測(cè)大腸桿菌菌株的chuA和yjaA基因以及DNA片段TspE4.C2，根據(jù)分群標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化群分群［1］。引物序列由上海生物工程有限公司合成，具體見(jiàn)表1和表2。DNA模板按菌落煮沸裂解法制備。PCR擴(kuò)增體系25 μL，包括GoTaq Green Master Mix 12.5 μL、上下游引物各 0.5 μL、模板 2 μL，雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

表1 chuA基因、yjaA基因和DNA片段TspE4.C2的引物序列

表2 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群判定標(biāo)準(zhǔn)

2.2 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 選取B2、D、B1和A群各15株菌株作為攻毒組，標(biāo)準(zhǔn)菌株O2作為陽(yáng)性對(duì)照組，空白對(duì)照組為陰性對(duì)照組，每株菌3只21日齡雌性BALB/C小白鼠，取0.2 mL的1010CFU/mL菌液對(duì)每只小鼠進(jìn)行皮下注射。根據(jù)小鼠的死亡數(shù)和病變程度確定分離株的致病性［1］。

2.3 最低抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn) 按照CLSI推薦的微量肉湯稀釋法進(jìn)行測(cè)定和判讀。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0軟件對(duì)兩組樣本率χ2檢驗(yàn)或兩尾Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 系統(tǒng)進(jìn)化群分群結(jié)果 438株雞源大腸桿菌中，B1群和 A群菌相對(duì)較多，分別占 38%(167/438)和 34%(149/438)，D 群占 21%(93/438)，而B(niǎo)2群菌株最少為6%(27/438)。不同基因片段PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同基因片段PCR產(chǎn)物電泳圖

3.2 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組:攻毒后小白鼠表現(xiàn)為精神萎靡，食欲下降，消瘦，體重下降，被毛蓬亂，拉稀，肌肉震顫，眼簾粘連，反應(yīng)遲鈍，蜷縮于籠子一角等臨床癥狀，有的甚至死亡。解剖注射大腸桿菌死亡的小白鼠發(fā)現(xiàn)，注射部位皮膚出現(xiàn)壞死灶，肝臟灰色腫大，脾臟比健康小白鼠的明顯縮小，邊緣呈暗紫色，胃內(nèi)充滿內(nèi)容物，十二指腸水腫，腸內(nèi)充滿黃色內(nèi)容物，腸壁變薄，下頜淋巴結(jié)腫大。各群菌株病死情況:D群，17 h內(nèi)所有小鼠均死亡;B2群，24 h內(nèi)67%的小鼠死亡;B1群，96 h內(nèi)33%的小鼠死亡;A群，直到168 h也未見(jiàn)小鼠死亡。陽(yáng)性對(duì)照組:致病性菌株O2組小白鼠出現(xiàn)與試驗(yàn)組相似的臨床癥狀，且24 h內(nèi)有67%的小鼠死亡。陰性對(duì)照組:空白對(duì)照組小白鼠均健活，撲殺時(shí)未見(jiàn)任何肉眼變化，心血、肝等器官未分離出任何細(xì)菌。

綜合臨床癥狀、死亡率及病死臟器分離菌株的鑒定結(jié)果，D群和B2群菌株致病性強(qiáng)，屬于高致病株;B1群菌株具有一定毒力，屬于低致病株;A群菌株雖有一些臨床癥狀，但基本不致病，屬于非致病株。

3.3 不同省區(qū)雞源大腸桿菌菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果438株雞源大腸桿菌對(duì)13種藥物具有不同程度的耐藥。耐藥嚴(yán)重的是青霉素類、四環(huán)素類和磺胺類(耐藥率≥80%)，粘桿菌素E最為敏感;多重耐藥問(wèn)題突出，433株為多重耐藥菌株，多重耐藥率高達(dá)98.86%，耐7種藥以上的菌株占77.18%;耐藥性存在空間差異，不同省區(qū)雞源大腸桿菌菌株對(duì)個(gè)別藥物的耐藥性差異顯著。結(jié)果見(jiàn)表3和圖2。

3.4 不同系統(tǒng)進(jìn)化群大腸桿菌菌株耐藥結(jié)果 不同系統(tǒng)進(jìn)化群雞源大腸桿菌菌株對(duì)13種藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥。高致病群B2和D群菌株的耐藥程度相對(duì)嚴(yán)重，其中 OFL、GM、SPT、EFT、SF、SXT、A/C等7種藥物差異顯著(P＜0.05);多重耐藥問(wèn)題相對(duì)突出，高耐菌株比例高于B1和A群菌株，79.17%的菌株耐8～12種藥物。具體結(jié)果見(jiàn)表4和圖3。

圖2 雞源大腸桿菌多重耐藥統(tǒng)計(jì)情況

表4 不同系統(tǒng)進(jìn)化群大腸桿菌菌株耐藥情況比較

圖3 不同系統(tǒng)進(jìn)化群大腸桿菌菌株耐藥率(A)和多重耐藥(B)比較

4 討論

4.1 系統(tǒng)進(jìn)化群分群分析 大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群可以分為 4個(gè)群:A、B1、B2和 D，它們依靠出現(xiàn)chuA、yjaA基因和 TspE4.C2非編碼區(qū)區(qū)分。A和B1群一般存在于共生株中，而B(niǎo)2和D群屬于攜帶毒力相關(guān)基因的條件腸外病原體［2］。Tetsuo Asai等［3］研究發(fā)現(xiàn)不同病死動(dòng)物大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群分布不同，A(49.4%)和D(44.9%)主要分布于雞源大腸桿菌，而B(niǎo)2群只出現(xiàn)在患病雞分離株上。Obeng等［4］研究了2008.12-2009.6期間南澳大利亞251株禽源大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)32.3～39.4%的分離株屬于共生群A和B1，11.2～17.1%屬于毒力群B2和D，17株多重耐藥菌株屬于B2和D群。巴西和日本的研究也顯示，健康牛、雞和豬中未見(jiàn)B2群大腸桿菌［5］。Rodriguez等［6］研究美國(guó)患病家禽大腸桿菌發(fā)現(xiàn)，A群(38%)和D群(28%)分布較多，B2群的檢出率為19%。本實(shí)驗(yàn)顯示，A和B1群的檢出率與其他國(guó)家相似，但高致病群存在差異，D群菌株檢出率比多數(shù)國(guó)家高出10%，并從健康雞中分離到B2群菌株，其他國(guó)家未見(jiàn)報(bào)道，說(shuō)明我國(guó)雞大腸桿菌的毒力較強(qiáng)，在適宜條件下更易導(dǎo)致家禽發(fā)病。

4.2 不同省區(qū)雞源大腸桿菌耐藥情況分析 近年來(lái)禽源大腸桿菌耐藥問(wèn)題日漸突出，耐藥譜不斷擴(kuò)大，耐藥程度日趨嚴(yán)重。李昆明等［7］檢測(cè)了河南17株禽大腸桿菌對(duì)24種抗菌藥的耐藥情況，結(jié)果顯示21種藥物的耐藥率大于70%，其中鏈霉素、青霉素、四環(huán)素、氯霉素等10種藥物的耐藥率高達(dá)90%。楊澤曉等［8］對(duì)四川87株大腸桿菌進(jìn)行26種抗菌藥的耐藥性檢測(cè)，受試菌株均有不同程度多重耐藥，對(duì)青霄素G(100%)、強(qiáng)力霉素(89.66%)、復(fù)方阿莫西林(85.20%)、四環(huán)素(82.76%)、頭孢氨芐(63.22%)、頭孢噻吩(52.87%)和復(fù)方新諾明(51.72%)的耐藥性較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)顯示，438株雞源大腸桿菌耐藥情況與以往報(bào)道相似，對(duì)青霉素類、四環(huán)素類和磺胺類藥物的耐藥較為嚴(yán)重，其中對(duì)氨芐西林的耐藥率高達(dá)87.21%，四環(huán)素和復(fù)方新諾明均為86.99%。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，不同省區(qū)雞源大腸桿菌菌株的耐藥性存在不同程度的差異，個(gè)別藥物差異顯著，如奧格門丁在山東和山西兩省耐藥率均達(dá)到80%以上，而河南、安徽、內(nèi)蒙和重慶四省則在20%左右，頭孢噻呋在山東和重慶均達(dá)到83%以上，其他省份則在36%左右。

4.3 不同系統(tǒng)進(jìn)化群菌株耐藥情況分析 已有報(bào)道系統(tǒng)進(jìn)化群可能與耐藥性的散播有關(guān)聯(lián)。本研究也發(fā)現(xiàn)，除了四環(huán)素外，B2和D群菌株對(duì)其余12種抗菌藥的耐藥率均高于 B1和A群菌株，其中OFL、GM、SPT、EFT、SF、SXT、A/C 等 7 種藥物差異顯著(P＜0.05);79.17%的B2和D群菌株耐8～12種藥物，而B(niǎo)1和A群耐8～12種藥物的菌株則有56.92%。說(shuō)明高致病群B2和D群菌株的耐藥程度相對(duì)嚴(yán)重，但與 Johnson［9］和 Picard［10］等報(bào)道臨床B2大腸桿菌分離株的抗菌藥耐藥性低于非B2分離株的結(jié)果不一致。

綜上所述，相比其他國(guó)家，我國(guó)雞源大腸桿菌致病力強(qiáng)，耐藥問(wèn)題突出，臨床菌株普遍產(chǎn)生耐藥性，而且高致病菌群菌株比低致病群和共生群菌株的耐藥程度更為嚴(yán)重，使得此類細(xì)菌性疾病的防治更加難以控制。目前對(duì)毒力和耐藥性之間的遺傳關(guān)系了解甚少，但已有報(bào)道證實(shí)，大腸桿菌毒力因子與耐藥性之間存在相關(guān)關(guān)系，下一步需要確定該類細(xì)菌在細(xì)菌譜系中的遺傳特征，研究調(diào)查在遺傳水平上耐藥性和毒力之間的相互作用，同時(shí)確定其表達(dá)機(jī)制，以便改進(jìn)對(duì)此類疾病的預(yù)防和控制。

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