盧玉婷，鄭丹丹，胡揚揚，張雅斌，張培軍，李月紅* ，冷東澤

(1.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，長春130118;2.吉林農業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心，長春130118;3.吉林省水產科學研究院，長春130000;4.吉林省衛(wèi)生監(jiān)測檢驗中心，長春130000)

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)屬于腸桿菌科腸道桿菌屬，廣泛存在于人和動物腸道、呼吸道以及水、土壤中。肺炎克雷伯氏菌是當前危害動物和人類最為嚴重的條件致病菌之一［1］，肺炎克雷伯氏菌分布廣泛，最先從大葉性肺炎病人的肺組織中分離到，當機體免疫力降低或長期服用抗生素導致菌群失調時易引起感染，若治療不當則死亡率極高［2］。隨著我國特種經濟動物養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，該病對毛皮動物和人類的危害日益嚴重，曾多次報道該病在人和動物中的發(fā)生和流行［3］。1999年至2002年北京、廣東、湖北和遼寧地區(qū)41家三級甲等醫(yī)院均出現(xiàn)人感染肺炎克雷伯氏菌疾病的案例［4］。該菌寄生在動物體內，也造成了養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失。2006年周玉龍［5］做了奶牛感染肺炎克雷伯氏菌后急性死亡的研究。2012年王孝友［6］從患病兔體內分離出肺炎克雷伯氏菌。而該菌對水生動物危害的報道很少，對鯉魚更是鮮有報道。1992年Singh［7］在海水魚、淡水魚等水產品中檢測到肺炎克雷伯氏菌;2007年唐毅［8］從發(fā)病白鰱肝臟和鰓部分離出肺炎克雷伯氏菌。2009年鄧國成［9］從發(fā)病鰻魚體內分離出肺炎克雷伯菌。目前尚未有研究性文獻明確該菌對鯉魚的危害。本試驗首次從患病鯉魚上分離到肺炎克雷伯氏菌，建立了該菌對鯉魚的發(fā)病模型，對其進行耐藥性測試并篩選了防治藥物，為預防和治療肺炎克雷伯氏菌引起的鯉科魚類疾病提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗病魚來自吉林農業(yè)大學藍湖，病魚鰓后緣、腹鰭基部、臀鰭基部、生殖口處均出現(xiàn)充血現(xiàn)象，部分魚腹部出現(xiàn)潰爛癥狀。魚鰓部微白。解剖病魚，有嚴重腥臭味腹水流出，腸道、肝胰臟、脾臟等處均出現(xiàn)充血癥狀，部分魚肌肉充血，膽囊腫大。

1.2 試驗儀器及試劑 150G全溫振蕩培養(yǎng)箱(金壇市國旺實驗儀器廠);立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9101-OSA型，上海三發(fā)科學儀器有限公司);超凈工作臺(SW-CJ-2FD型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);PhoenixTM-100鳳凰全自動細菌鑒定/藥敏檢測系統(tǒng);革蘭氏染色試劑盒(上海銘睿生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 病原菌的分離純化 在無菌條件下進行患病鯉魚鰓和肝胰臟組織的采取，用研缽碾碎后制成組織懸液，用接種環(huán)挑取組織液在普通瓊脂平板上劃線，在37℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況。挑取形態(tài)和結構，顏色相同的單個菌落在普通瓊脂平板上劃線分離純化，待菌落成單個均勻分布，挑取單個菌落采用甘油保藏法保存。

1.3.2 病原菌的鑒定

1.3.2.1 革蘭氏染色法 在潔凈的載玻片上滴一滴生理鹽水，將分離純化的細菌在無菌條件下用接種環(huán)挑取單個菌落，均勻涂布于生理鹽水中干燥固定，經結晶紫染色、碘染、酒精脫色、蕃紅染色后鏡檢。

1.3.2.2 生化鑒定 采用PhoenixTM-100鳳凰全自動細菌鑒定系統(tǒng)，鑒定板為革蘭氏陰性菌鑒定板，51孔，試驗周期15 h結束后觀察實驗結果并分析。

1.3.2.3 藥物敏感試驗 采用PhoenixTM-100鳳凰全自動細菌藥敏檢測系統(tǒng)，鑒定板為革蘭氏陰性菌藥敏板，85孔，試驗周期15 h結束后觀察試驗結果并分析。

1.3.2.4 回歸試驗 取體格健壯、游動活躍的黃河鯉魚192條，平均規(guī)格200 g左右。隨機分為4組，分別為試驗組1，試驗組2，試驗組3和對照組，每組48條。將4組魚同時放入相同水環(huán)境不同魚缸中(浴缸規(guī)格為80 cm×60 cm×100 cm)，30℃暫養(yǎng)一周。待魚基本穩(wěn)定后，試驗組每條魚用腹腔注射法注射菌液(培養(yǎng)液為普通肉湯)0.5mL，對照組每條魚注射相同無菌普通肉湯培養(yǎng)液0.5 mL。30℃水溫下飼養(yǎng)7 d，觀察魚體變化，并記錄。

1.3.2.5 細菌的分離鑒定 對1.3.2.4中發(fā)病魚進行細菌分離培養(yǎng)，方法同1.3.1。對分離出的細菌進行革蘭氏染色和生理生化檢驗，分析結果。

2 試驗結果

2.1 革蘭氏染色結果 革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察到短桿狀、紅色細菌，單個存在或2個相連(見圖1)，表明該細菌呈革蘭氏陰性.來自于鯉魚肝臟和鰓部分離的菌株具有相同的菌體特征。

圖1 革蘭氏染色鏡下圖

2.2 生化鑒定結果 如表1可知該菌與七葉苷、PNP-BD-糖苷、Beta-葡二糖等反應呈陽性，表明該菌能發(fā)酵或利用這些物質;而與戊二酰-甘氨酸-精氨酸-AMC、黏菌素、4MU-N-乙酰-BD-氨基葡萄甘等反應呈陰性。

2.3 藥物敏感試驗結果 如表2所示，可知該菌對亞胺培南、美洛培南、頭孢他啶、頭孢噻肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星等高度敏感，對氨芐西林耐藥性最強。

表2 藥敏試驗結果

2.4 回歸試驗結果 在注射菌液36 h后，魚吃食量明顯下降甚至不吃食。48 h之后部分魚開始死亡。試驗周期結束后，試驗組三個魚缸均出現(xiàn)不同數(shù)量發(fā)病死魚，而對照組魚無發(fā)病死亡出現(xiàn)(見表3)。

觀察死亡魚，發(fā)現(xiàn)其體表有明顯充血塊，尤其是在胸鰭、腹鰭和生殖口處明顯，部分魚體腹鰭基部出現(xiàn)潰爛現(xiàn)象。解剖病魚有濃烈腥臭味的腹水流出，魚內臟嚴重充血，肝胰臟、脾臟及腸道均出現(xiàn)明顯充血現(xiàn)象。

2.5 細菌的分離鑒定結果 根據(jù)上述革蘭氏染色反應及生理生化檢驗，得到細菌的特征與上述分離的肺炎克雷伯氏菌的特征完全相符。

表3 回歸試驗結果

3 討論與小結

本試驗首次從發(fā)病鯉魚體內分離出肺炎克雷伯氏菌。該菌使鯉魚發(fā)病，表現(xiàn)出身體大部分充血，部分魚腹部出現(xiàn)潰爛癥狀，魚鰓部微白。解剖病魚，有嚴重腥臭味腹水流出，內臟多處出現(xiàn)充血癥狀，部分魚肌肉充血，膽囊腫大。此發(fā)病現(xiàn)象與唐毅［8］等人研究的白鰱感染該菌的癥狀相似。

從革蘭氏染色結果來看，該菌在顯微鏡下呈現(xiàn)短桿狀、紅色，單個存在或2個相連，此結果和徐海圣［10］的基本相同。生化鑒定結果中得到該菌與七葉苷、PNP-BD-糖苷、Beta-葡二糖等反應呈陽性，表明該菌能發(fā)酵或利用這些物質;與戊二酰-甘氨酸-精氨酸-AMC、黏菌素、4MU-N-乙酰-BD-氨基葡萄甘等反應呈陰性。

人患克雷伯氏菌肺炎較一般肺炎病情重，對一般肺炎常用的首選藥物青霉素無效［11］。大量的流行病學調查資料顯示，近年來由于各種抗菌藥物的廣泛使用，導致肺炎克雷伯氏菌耐藥性普遍存在，且多數(shù)的分離株都為多重抗藥性的菌種，耐藥性日趨嚴重，其耐藥機制又較復雜，在治療上造成極大的困擾［12］。本試驗所做的肺炎克雷伯氏菌藥物敏感試驗，分離出了一些高度敏感的藥物:亞胺培南、美洛培南、頭孢他啶、頭孢噻肟、左氧氟沙星、黏菌素和環(huán)丙沙星。說明該菌對這些藥物十分敏感，這對開發(fā)治療由肺炎克雷伯菌引起的疾病有很好的幫助作用［13］，此結果和張芬［14］等人的研究結果基本一致。而該菌對氨芐西林產生耐藥性，說明該菌對氨芐西林已經產生抵抗能力，繼續(xù)使用該藥物已經達不到良好的效果。

本試驗所進行的試驗最終確定該病原菌為肺炎克雷伯氏菌。藥敏試驗結果分離出幾種高度敏感的藥物，為治療和預防該菌對鯉魚的危害提供可靠實驗數(shù)據(jù)和依據(jù)。因鯉魚感染肺炎克雷伯菌的研究較少，一些具體的發(fā)病機制和毒力基因等方面的研究仍需要進一步探究。

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