胡選萍+陳志遠(yuǎn)

摘要：以耐寒柑橘（Critus reticulata Blanco）為試材，研究了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2，4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響，優(yōu)化柑橘愈傷組織培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中MT培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基，統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著；帶外種皮消毒處理方式更有利于外植體的脫分化，愈傷誘導(dǎo)率均在90%以上；胚與子葉外植體分別在f與i培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳，其誘導(dǎo)率為93.10%與93.33%；培養(yǎng)基中2，4-D濃度為2.0～3.0 mg/L適合柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)，且激素KT與2，4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用，當(dāng)培養(yǎng)基中KT為0.5 mg/L時，誘導(dǎo)率增加25.75%，疏松愈傷率增加14.48%。

關(guān)鍵詞：耐寒柑橘（Critus reticulata Blanco）；愈傷組織；誘導(dǎo)；優(yōu)化

中圖分類號：S666 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4460-04

柑橘（Citrus reticulata Blanco）是世界四大水果之一，其國際貿(mào)易額位居世界第3，僅次于小麥和蔬菜[1，2]。柑橘隸屬蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus），其營養(yǎng)成分豐富，富含黃酮[3]，具有抗氧化、抗病毒、抗炎癥、抗癌活性、預(yù)防動脈硬化等作用[4，5]。陜西省漢中市城固縣作為陜南最大的柑橘生產(chǎn)基地，通過國家綠色食品發(fā)展中心認(rèn)證的柑橘生產(chǎn)基地面積達到6 667 hm2，被國家林業(yè)部命名為“中國柑橘之鄉(xiāng)”[6]。柑橘作為陜南重要的經(jīng)濟作物之一，在農(nóng)業(yè)區(qū)域規(guī)劃中被放在重點優(yōu)先發(fā)展的地位。由于柑橘對低溫比較敏感，而漢中地區(qū)處亞熱帶北緣，冬季低溫和秋季多雨導(dǎo)致柑橘局部凍害一直是制約柑橘產(chǎn)業(yè)大發(fā)展的重要因素，因此提高柑橘的抗逆性對于柑橘產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。近年來生物技術(shù)被廣泛應(yīng)用于柑橘抗性資源的研究與開發(fā)利用中，并取得了顯著成果[7]。

本研究以耐寒柑橘為試材，研究了不同因子對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)方式與效應(yīng)程度，為深入研究耐寒柑橘體細(xì)胞胚胎發(fā)生及抗寒機理提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為陜西省漢中市城固縣柑橘生產(chǎn)基地的早熟耐寒品種日南1號，外植體來源于成熟柑橘果實種子，經(jīng)晾曬、去雜后，剝離出未受精敗育種子胚與子葉作為研究試材。

試驗用NAA、6-BA、2，4-D與KT均為分析純；MS與MT培養(yǎng)基自配。

1.2 方法

1.2.1 外植體的預(yù)處理 選擇飽滿圓潤、大小均一的柑橘種子浸泡8 h，用自來水沖洗掉表面的雜質(zhì)，在流水下沖洗1～2 h，備用。在超凈工作臺將柑橘種子直接或剝離外種皮后用75%的乙醇表面消毒30 s，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡8～10 min，處理過程中不斷搖動，然后用無菌水沖洗5～6次，每次2～3 min。在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中分離出胚與子葉，胚直接接種，子葉切分為長寬約為0.5 cm的小塊作為外植體。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 分別以MS與MT為基本培養(yǎng)基，按3.0%的量加入蔗糖，按0.6%的量加入瓊脂粉，添加以不同種類與濃度配比的生長調(diào)節(jié)因子，設(shè)計為16種組合配比（表1），調(diào)節(jié)pH為5.8～6.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo) 無菌操作條件下，將柑橘種子胚接入a～i培養(yǎng)基，子葉接入Ⅰ～Ⅶ及a～i培養(yǎng)基中。在溫度（25±2） ℃，相對濕度50%～60%的條件下，暗培養(yǎng)4周，觀察愈傷的發(fā)生時間、顏色、質(zhì)地及生長情況，統(tǒng)計體積明顯膨大的外植體數(shù)與誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)，并依此計算出相應(yīng)的二級變量。接種15 d后，去除污染與壞死材料，統(tǒng)計無菌外植體數(shù)（視為接種量），接種3周統(tǒng)計膨大的外植體數(shù)（視為膨大數(shù)），計算膨大率，膨大率=膨大數(shù)/接種量×100%。統(tǒng)計接種4周誘導(dǎo)出愈的外植體數(shù)（視為誘導(dǎo)數(shù)）與疏松愈傷組織的外植體數(shù)（視為疏松數(shù)），計算誘導(dǎo)率與疏松愈傷率，誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)數(shù)/接種量×100%；疏松愈傷率=疏松數(shù)/誘導(dǎo)數(shù)×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表2中可以看出，對于MS與MT兩種培養(yǎng)基體系而言，MT培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基。MT培養(yǎng)基中愈傷組織發(fā)生時間提前1 d左右，且愈傷組織呈淡黃色，質(zhì)地疏松，生長旺盛，品質(zhì)好，后期褐變程度低。在MT培養(yǎng)基中（其中激素為2.0 mg/L 2，4-D），子葉外植體的膨大率（91.75%）與愈傷誘導(dǎo)率（87.61%）明顯高于MS培養(yǎng)基，且兩種不同處理間差異顯著（P<0.05）。同樣對于處理Ⅱ與處理Ⅵ（培養(yǎng)基中激素2.0 mg/L 2，4-D、0.5 mg/L KT）而言，處理Ⅵ的誘導(dǎo)率（94.31%）明顯高于處理Ⅱ（86.58%），表現(xiàn)出相似的MT誘導(dǎo)優(yōu)勢。因此，對于耐寒柑橘子葉外植體而言，MT為相對合適的基本培養(yǎng)基質(zhì)。

2.2 消毒處理方式對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

采用兩種不同外植體消毒處理方式：帶外種皮消毒處理，即柑橘種子不用預(yù)先剝?nèi)ネ夥N皮，直接用75%乙醇表面消毒30 s后，再用0.1% HgCl2浸泡10 min；不帶外種皮消毒處理，即先剝離外種皮，然后用75%乙醇與0.1% HgCl2配合消毒，乙醇處理同上，0.1% HgCl2處理8 min。試驗表明在兩種不同消毒處理方式下，柑橘子葉外植體脫分化與愈傷組織誘導(dǎo)形成存在明顯差異（圖1、圖2）。

帶外種皮消毒處理雖然子葉剝離略微困難，但外植體脫分化狀態(tài)較好，外植體多呈淡綠色，在培養(yǎng)初期均出現(xiàn)明顯膨大，5 d左右開始出現(xiàn)愈傷組織，且愈傷多呈現(xiàn)淡黃綠色，透明有光澤，且愈傷組織生長速度快，積累量較大。而不帶外種皮消毒處理消毒處理方式，外植體培養(yǎng)2～3 d后顏色變白，膨大程度較低，愈傷組織出現(xiàn)時間也相對較晚，大約7～10 d后有淡黃色的愈傷組織形成，到第4周愈傷組織的誘導(dǎo)形成基本穩(wěn)定，且愈傷積累量總體較少。從愈傷誘導(dǎo)效果來看，帶外種皮消毒明顯比不帶外種皮消毒脫分化效果好（圖1、圖2），不帶外種皮消毒處理柑橘子葉在Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率為80%左右，而帶外種皮消毒處理中外植體愈傷誘導(dǎo)率均在90%以上，甚至在處理Ⅱ可達到完全脫分化（誘導(dǎo)率100%），t檢驗表明，兩種消毒處理方式的膨大率與誘導(dǎo)率均差異顯著（P<0.05）。endprint

2.3 外植體類型對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別將柑橘子葉和胚外植體接種于a～i培養(yǎng)基中，柑橘種子胚在第5天左右開始膨大，子葉則相對遲緩，外植體膨大時間略晚（2～3 d），10～14 d為膨大高峰期（圖3、圖4）。二者均在7 d左右在外植體表面出現(xiàn)少量顆粒狀愈傷組織，15～20 d愈傷組織形成與積累達到相對高峰。胚作為外植體形成的愈傷組織多發(fā)生在外植體側(cè)面或遠(yuǎn)培養(yǎng)基端，愈傷多成淡黃色或乳白色；子葉愈傷組織的多發(fā)生在外植體側(cè)面與近培養(yǎng)基端居多，且愈傷多呈淡黃色。

對于胚而言，在f培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳（誘導(dǎo)率93.10%），而同樣條件下子葉外植體脫分化效果處于較低水平（誘導(dǎo)率43.33%）；同樣，對于子葉而言愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳的激素組合配比為i培養(yǎng)基（誘導(dǎo)率93.33%），而此條件對胚（誘導(dǎo)率61.54%）并非最佳。由此可見，兩種外植體對不同生長調(diào)節(jié)因子的敏感性存在較大差異，需要針對外植體的特點，選擇適合該外植體愈傷組織誘導(dǎo)的恰當(dāng)?shù)募に胤N類與濃度配比條件。

2.4 激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4.1 2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表3。Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間在膨大率與誘導(dǎo)率兩個效應(yīng)變量上差異顯著。結(jié)果表明， 2，4-D是影響柑橘子葉外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織的重要因子。當(dāng)2，4-D濃度為2.0 mg/L（處理Ⅱ）時誘導(dǎo)率為86.58%，顯著高于處理Ⅰ（72.33%）（P<0.05），較高濃度2，4-D更有利于愈傷組織的發(fā)生；處理Ⅱ與處理Ⅲ之間差異不顯著，2.0～3.0 mg/L 2，4-D是柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)較為合適的濃度范圍。2，4-D對柑橘愈傷組織的結(jié)構(gòu)與質(zhì)地沒有明顯的影響作用，Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間疏松愈傷組織的誘導(dǎo)率差異不顯著。

2.4.2 KT對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 培養(yǎng)基中2，4-D濃度為2.0 mg/L水平， KT濃度對柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表4。培養(yǎng)基中添加KT可使愈傷組織的誘導(dǎo)率增加13.04%（KT為0.1 mg/L）與 25.75%（KT為0.5 mg/L），培養(yǎng)基中KT激素的添加對柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)具有一定的促進作用。KT與2，4-D配合使用更加有利于外植體的脫分化，膨大率與誘導(dǎo)率效果顯著性高于使用2，4-D（P<0.05）；且形成的愈傷組織中疏松愈傷組織占的比例相對較大，愈傷組織的積累量也較多。在柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中KT與2，4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用。

3 小結(jié)與討論

愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生受外植體類型、光照條件、植物基因型等諸多因素的影響，其中植物生長物質(zhì)對植物離體培養(yǎng)中的細(xì)胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調(diào)節(jié)作用[8]，尤其是生長素類和細(xì)胞分裂素類的對于誘導(dǎo)原基的形成非常重要[9，10]。本試驗以耐寒柑橘為試材，分析了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2，4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)。結(jié)果表明，MT培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比，更有利于耐寒柑橘愈傷組織的發(fā)生和愈傷組織的積累。MS培養(yǎng)基是普遍使用的植物組培培養(yǎng)基，其對固體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織效果明顯。MT培養(yǎng)基不僅保留了MS培養(yǎng)基中高硝酸鹽、鉀和銨的特點，而且含有更為豐富的煙酸、維生素B6等有機物，能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求，是一種較適合柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

帶外種皮消毒能夠相對更好地保持柑橘種子胚與子葉細(xì)胞相對高活力狀態(tài)，因此更有利于其脫分化與愈傷組織形成。柑橘種子胚與子葉在不同激素組合培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)效果差異很大，其適合的激素組合濃度配比不同，這可能與外植體本身所含的外植體的種類、質(zhì)量濃度水平差異和對外源激素的反應(yīng)靈敏性不同有關(guān)[11]。在多數(shù)植物愈傷組織的誘導(dǎo)中，2，4-D是一個很有效的激素[12，13]，對柑橘而言，較高質(zhì)量濃度的2，4-D同樣有利于愈傷組織的發(fā)生，但2，4-D只影響柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)率，而對愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì)沒有顯著影響。添加一定濃度的KT可以很大程度上增加了愈傷組織的誘導(dǎo)率，而且可以改變愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì)，更有利于疏松愈傷組織的形成與積累，這充分證明了KT與2，4-D在愈傷誘導(dǎo)方面的協(xié)同促進作用。

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[13]張彩俠，曹 彬，史 梅.不同激素對大葉黃楊幼莖愈傷組織的誘導(dǎo)試驗[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（8）：25-27.endprint

2.3 外植體類型對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別將柑橘子葉和胚外植體接種于a～i培養(yǎng)基中，柑橘種子胚在第5天左右開始膨大，子葉則相對遲緩，外植體膨大時間略晚（2～3 d），10～14 d為膨大高峰期（圖3、圖4）。二者均在7 d左右在外植體表面出現(xiàn)少量顆粒狀愈傷組織，15～20 d愈傷組織形成與積累達到相對高峰。胚作為外植體形成的愈傷組織多發(fā)生在外植體側(cè)面或遠(yuǎn)培養(yǎng)基端，愈傷多成淡黃色或乳白色；子葉愈傷組織的多發(fā)生在外植體側(cè)面與近培養(yǎng)基端居多，且愈傷多呈淡黃色。

對于胚而言，在f培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳（誘導(dǎo)率93.10%），而同樣條件下子葉外植體脫分化效果處于較低水平（誘導(dǎo)率43.33%）；同樣，對于子葉而言愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳的激素組合配比為i培養(yǎng)基（誘導(dǎo)率93.33%），而此條件對胚（誘導(dǎo)率61.54%）并非最佳。由此可見，兩種外植體對不同生長調(diào)節(jié)因子的敏感性存在較大差異，需要針對外植體的特點，選擇適合該外植體愈傷組織誘導(dǎo)的恰當(dāng)?shù)募に胤N類與濃度配比條件。

2.4 激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4.1 2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表3。Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間在膨大率與誘導(dǎo)率兩個效應(yīng)變量上差異顯著。結(jié)果表明， 2，4-D是影響柑橘子葉外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織的重要因子。當(dāng)2，4-D濃度為2.0 mg/L（處理Ⅱ）時誘導(dǎo)率為86.58%，顯著高于處理Ⅰ（72.33%）（P<0.05），較高濃度2，4-D更有利于愈傷組織的發(fā)生；處理Ⅱ與處理Ⅲ之間差異不顯著，2.0～3.0 mg/L 2，4-D是柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)較為合適的濃度范圍。2，4-D對柑橘愈傷組織的結(jié)構(gòu)與質(zhì)地沒有明顯的影響作用，Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間疏松愈傷組織的誘導(dǎo)率差異不顯著。

2.4.2 KT對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 培養(yǎng)基中2，4-D濃度為2.0 mg/L水平， KT濃度對柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表4。培養(yǎng)基中添加KT可使愈傷組織的誘導(dǎo)率增加13.04%（KT為0.1 mg/L）與 25.75%（KT為0.5 mg/L），培養(yǎng)基中KT激素的添加對柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)具有一定的促進作用。KT與2，4-D配合使用更加有利于外植體的脫分化，膨大率與誘導(dǎo)率效果顯著性高于使用2，4-D（P<0.05）；且形成的愈傷組織中疏松愈傷組織占的比例相對較大，愈傷組織的積累量也較多。在柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中KT與2，4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用。

3 小結(jié)與討論

愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生受外植體類型、光照條件、植物基因型等諸多因素的影響，其中植物生長物質(zhì)對植物離體培養(yǎng)中的細(xì)胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調(diào)節(jié)作用[8]，尤其是生長素類和細(xì)胞分裂素類的對于誘導(dǎo)原基的形成非常重要[9，10]。本試驗以耐寒柑橘為試材，分析了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2，4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)。結(jié)果表明，MT培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比，更有利于耐寒柑橘愈傷組織的發(fā)生和愈傷組織的積累。MS培養(yǎng)基是普遍使用的植物組培培養(yǎng)基，其對固體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織效果明顯。MT培養(yǎng)基不僅保留了MS培養(yǎng)基中高硝酸鹽、鉀和銨的特點，而且含有更為豐富的煙酸、維生素B6等有機物，能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求，是一種較適合柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

帶外種皮消毒能夠相對更好地保持柑橘種子胚與子葉細(xì)胞相對高活力狀態(tài)，因此更有利于其脫分化與愈傷組織形成。柑橘種子胚與子葉在不同激素組合培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)效果差異很大，其適合的激素組合濃度配比不同，這可能與外植體本身所含的外植體的種類、質(zhì)量濃度水平差異和對外源激素的反應(yīng)靈敏性不同有關(guān)[11]。在多數(shù)植物愈傷組織的誘導(dǎo)中，2，4-D是一個很有效的激素[12，13]，對柑橘而言，較高質(zhì)量濃度的2，4-D同樣有利于愈傷組織的發(fā)生，但2，4-D只影響柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)率，而對愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì)沒有顯著影響。添加一定濃度的KT可以很大程度上增加了愈傷組織的誘導(dǎo)率，而且可以改變愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì)，更有利于疏松愈傷組織的形成與積累，這充分證明了KT與2，4-D在愈傷誘導(dǎo)方面的協(xié)同促進作用。

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2.3 外植體類型對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別將柑橘子葉和胚外植體接種于a～i培養(yǎng)基中，柑橘種子胚在第5天左右開始膨大，子葉則相對遲緩，外植體膨大時間略晚（2～3 d），10～14 d為膨大高峰期（圖3、圖4）。二者均在7 d左右在外植體表面出現(xiàn)少量顆粒狀愈傷組織，15～20 d愈傷組織形成與積累達到相對高峰。胚作為外植體形成的愈傷組織多發(fā)生在外植體側(cè)面或遠(yuǎn)培養(yǎng)基端，愈傷多成淡黃色或乳白色；子葉愈傷組織的多發(fā)生在外植體側(cè)面與近培養(yǎng)基端居多，且愈傷多呈淡黃色。

對于胚而言，在f培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳（誘導(dǎo)率93.10%），而同樣條件下子葉外植體脫分化效果處于較低水平（誘導(dǎo)率43.33%）；同樣，對于子葉而言愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳的激素組合配比為i培養(yǎng)基（誘導(dǎo)率93.33%），而此條件對胚（誘導(dǎo)率61.54%）并非最佳。由此可見，兩種外植體對不同生長調(diào)節(jié)因子的敏感性存在較大差異，需要針對外植體的特點，選擇適合該外植體愈傷組織誘導(dǎo)的恰當(dāng)?shù)募に胤N類與濃度配比條件。

2.4 激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4.1 2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表3。Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間在膨大率與誘導(dǎo)率兩個效應(yīng)變量上差異顯著。結(jié)果表明， 2，4-D是影響柑橘子葉外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織的重要因子。當(dāng)2，4-D濃度為2.0 mg/L（處理Ⅱ）時誘導(dǎo)率為86.58%，顯著高于處理Ⅰ（72.33%）（P<0.05），較高濃度2，4-D更有利于愈傷組織的發(fā)生；處理Ⅱ與處理Ⅲ之間差異不顯著，2.0～3.0 mg/L 2，4-D是柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)較為合適的濃度范圍。2，4-D對柑橘愈傷組織的結(jié)構(gòu)與質(zhì)地沒有明顯的影響作用，Ⅰ～Ⅲ培養(yǎng)基之間疏松愈傷組織的誘導(dǎo)率差異不顯著。

2.4.2 KT對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 培養(yǎng)基中2，4-D濃度為2.0 mg/L水平， KT濃度對柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表4。培養(yǎng)基中添加KT可使愈傷組織的誘導(dǎo)率增加13.04%（KT為0.1 mg/L）與 25.75%（KT為0.5 mg/L），培養(yǎng)基中KT激素的添加對柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)具有一定的促進作用。KT與2，4-D配合使用更加有利于外植體的脫分化，膨大率與誘導(dǎo)率效果顯著性高于使用2，4-D（P<0.05）；且形成的愈傷組織中疏松愈傷組織占的比例相對較大，愈傷組織的積累量也較多。在柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中KT與2，4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用。

3 小結(jié)與討論

愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生受外植體類型、光照條件、植物基因型等諸多因素的影響，其中植物生長物質(zhì)對植物離體培養(yǎng)中的細(xì)胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調(diào)節(jié)作用[8]，尤其是生長素類和細(xì)胞分裂素類的對于誘導(dǎo)原基的形成非常重要[9，10]。本試驗以耐寒柑橘為試材，分析了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2，4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)。結(jié)果表明，MT培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比，更有利于耐寒柑橘愈傷組織的發(fā)生和愈傷組織的積累。MS培養(yǎng)基是普遍使用的植物組培培養(yǎng)基，其對固體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織效果明顯。MT培養(yǎng)基不僅保留了MS培養(yǎng)基中高硝酸鹽、鉀和銨的特點，而且含有更為豐富的煙酸、維生素B6等有機物，能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求，是一種較適合柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

帶外種皮消毒能夠相對更好地保持柑橘種子胚與子葉細(xì)胞相對高活力狀態(tài)，因此更有利于其脫分化與愈傷組織形成。柑橘種子胚與子葉在不同激素組合培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)效果差異很大，其適合的激素組合濃度配比不同，這可能與外植體本身所含的外植體的種類、質(zhì)量濃度水平差異和對外源激素的反應(yīng)靈敏性不同有關(guān)[11]。在多數(shù)植物愈傷組織的誘導(dǎo)中，2，4-D是一個很有效的激素[12，13]，對柑橘而言，較高質(zhì)量濃度的2，4-D同樣有利于愈傷組織的發(fā)生，但2，4-D只影響柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)率，而對愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì)沒有顯著影響。添加一定濃度的KT可以很大程度上增加了愈傷組織的誘導(dǎo)率，而且可以改變愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì)，更有利于疏松愈傷組織的形成與積累，這充分證明了KT與2，4-D在愈傷誘導(dǎo)方面的協(xié)同促進作用。

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