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耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化

2014-11-20 18:34胡選萍陳志遠(yuǎn)
湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年18期
關(guān)鍵詞:愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化

胡選萍+陳志遠(yuǎn)

摘要:以耐寒柑橘(Critus reticulata Blanco)為試材,研究了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2,4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響,優(yōu)化柑橘愈傷組織培養(yǎng)條件。結(jié)果表明,柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中MT培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基,統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著;帶外種皮消毒處理方式更有利于外植體的脫分化,愈傷誘導(dǎo)率均在90%以上;胚與子葉外植體分別在f與i培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳,其誘導(dǎo)率為93.10%與93.33%;培養(yǎng)基中2,4-D濃度為2.0~3.0 mg/L適合柑橘愈傷組織的誘導(dǎo),且激素KT與2,4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用,當(dāng)培養(yǎng)基中KT為0.5 mg/L時,誘導(dǎo)率增加25.75%,疏松愈傷率增加14.48%。

關(guān)鍵詞:耐寒柑橘(Critus reticulata Blanco);愈傷組織;誘導(dǎo);優(yōu)化

中圖分類號:S666 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2014)18-4460-04

柑橘(Citrus reticulata Blanco)是世界四大水果之一,其國際貿(mào)易額位居世界第3,僅次于小麥和蔬菜[1,2]。柑橘隸屬蕓香科(Rutaceae)柑橘屬(Citrus),其營養(yǎng)成分豐富,富含黃酮[3],具有抗氧化、抗病毒、抗炎癥、抗癌活性、預(yù)防動脈硬化等作用[4,5]。陜西省漢中市城固縣作為陜南最大的柑橘生產(chǎn)基地,通過國家綠色食品發(fā)展中心認(rèn)證的柑橘生產(chǎn)基地面積達到6 667 hm2,被國家林業(yè)部命名為“中國柑橘之鄉(xiāng)”[6]。柑橘作為陜南重要的經(jīng)濟作物之一,在農(nóng)業(yè)區(qū)域規(guī)劃中被放在重點優(yōu)先發(fā)展的地位。由于柑橘對低溫比較敏感,而漢中地區(qū)處亞熱帶北緣,冬季低溫和秋季多雨導(dǎo)致柑橘局部凍害一直是制約柑橘產(chǎn)業(yè)大發(fā)展的重要因素,因此提高柑橘的抗逆性對于柑橘產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。近年來生物技術(shù)被廣泛應(yīng)用于柑橘抗性資源的研究與開發(fā)利用中,并取得了顯著成果[7]。

本研究以耐寒柑橘為試材,研究了不同因子對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)方式與效應(yīng)程度,為深入研究耐寒柑橘體細(xì)胞胚胎發(fā)生及抗寒機理提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為陜西省漢中市城固縣柑橘生產(chǎn)基地的早熟耐寒品種日南1號,外植體來源于成熟柑橘果實種子,經(jīng)晾曬、去雜后,剝離出未受精敗育種子胚與子葉作為研究試材。

試驗用NAA、6-BA、2,4-D與KT均為分析純;MS與MT培養(yǎng)基自配。

1.2 方法

1.2.1 外植體的預(yù)處理 選擇飽滿圓潤、大小均一的柑橘種子浸泡8 h,用自來水沖洗掉表面的雜質(zhì),在流水下沖洗1~2 h,備用。在超凈工作臺將柑橘種子直接或剝離外種皮后用75%的乙醇表面消毒30 s,再用0.1%升汞(HgCl2)浸泡8~10 min,處理過程中不斷搖動,然后用無菌水沖洗5~6次,每次2~3 min。在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中分離出胚與子葉,胚直接接種,子葉切分為長寬約為0.5 cm的小塊作為外植體。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 分別以MS與MT為基本培養(yǎng)基,按3.0%的量加入蔗糖,按0.6%的量加入瓊脂粉,添加以不同種類與濃度配比的生長調(diào)節(jié)因子,設(shè)計為16種組合配比(表1),調(diào)節(jié)pH為5.8~6.0,121 ℃滅菌20 min。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo) 無菌操作條件下,將柑橘種子胚接入a~i培養(yǎng)基,子葉接入Ⅰ~Ⅶ及a~i培養(yǎng)基中。在溫度(25±2) ℃,相對濕度50%~60%的條件下,暗培養(yǎng)4周,觀察愈傷的發(fā)生時間、顏色、質(zhì)地及生長情況,統(tǒng)計體積明顯膨大的外植體數(shù)與誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù),并依此計算出相應(yīng)的二級變量。接種15 d后,去除污染與壞死材料,統(tǒng)計無菌外植體數(shù)(視為接種量),接種3周統(tǒng)計膨大的外植體數(shù)(視為膨大數(shù)),計算膨大率,膨大率=膨大數(shù)/接種量×100%。統(tǒng)計接種4周誘導(dǎo)出愈的外植體數(shù)(視為誘導(dǎo)數(shù))與疏松愈傷組織的外植體數(shù)(視為疏松數(shù)),計算誘導(dǎo)率與疏松愈傷率,誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)數(shù)/接種量×100%;疏松愈傷率=疏松數(shù)/誘導(dǎo)數(shù)×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表2中可以看出,對于MS與MT兩種培養(yǎng)基體系而言,MT培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)效果明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基。MT培養(yǎng)基中愈傷組織發(fā)生時間提前1 d左右,且愈傷組織呈淡黃色,質(zhì)地疏松,生長旺盛,品質(zhì)好,后期褐變程度低。在MT培養(yǎng)基中(其中激素為2.0 mg/L 2,4-D),子葉外植體的膨大率(91.75%)與愈傷誘導(dǎo)率(87.61%)明顯高于MS培養(yǎng)基,且兩種不同處理間差異顯著(P<0.05)。同樣對于處理Ⅱ與處理Ⅵ(培養(yǎng)基中激素2.0 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L KT)而言,處理Ⅵ的誘導(dǎo)率(94.31%)明顯高于處理Ⅱ(86.58%),表現(xiàn)出相似的MT誘導(dǎo)優(yōu)勢。因此,對于耐寒柑橘子葉外植體而言,MT為相對合適的基本培養(yǎng)基質(zhì)。

2.2 消毒處理方式對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

采用兩種不同外植體消毒處理方式:帶外種皮消毒處理,即柑橘種子不用預(yù)先剝?nèi)ネ夥N皮,直接用75%乙醇表面消毒30 s后,再用0.1% HgCl2浸泡10 min;不帶外種皮消毒處理,即先剝離外種皮,然后用75%乙醇與0.1% HgCl2配合消毒,乙醇處理同上,0.1% HgCl2處理8 min。試驗表明在兩種不同消毒處理方式下,柑橘子葉外植體脫分化與愈傷組織誘導(dǎo)形成存在明顯差異(圖1、圖2)。

帶外種皮消毒處理雖然子葉剝離略微困難,但外植體脫分化狀態(tài)較好,外植體多呈淡綠色,在培養(yǎng)初期均出現(xiàn)明顯膨大,5 d左右開始出現(xiàn)愈傷組織,且愈傷多呈現(xiàn)淡黃綠色,透明有光澤,且愈傷組織生長速度快,積累量較大。而不帶外種皮消毒處理消毒處理方式,外植體培養(yǎng)2~3 d后顏色變白,膨大程度較低,愈傷組織出現(xiàn)時間也相對較晚,大約7~10 d后有淡黃色的愈傷組織形成,到第4周愈傷組織的誘導(dǎo)形成基本穩(wěn)定,且愈傷積累量總體較少。從愈傷誘導(dǎo)效果來看,帶外種皮消毒明顯比不帶外種皮消毒脫分化效果好(圖1、圖2),不帶外種皮消毒處理柑橘子葉在Ⅰ~Ⅲ培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率為80%左右,而帶外種皮消毒處理中外植體愈傷誘導(dǎo)率均在90%以上,甚至在處理Ⅱ可達到完全脫分化(誘導(dǎo)率100%),t檢驗表明,兩種消毒處理方式的膨大率與誘導(dǎo)率均差異顯著(P<0.05)。endprint

2.3 外植體類型對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別將柑橘子葉和胚外植體接種于a~i培養(yǎng)基中,柑橘種子胚在第5天左右開始膨大,子葉則相對遲緩,外植體膨大時間略晚(2~3 d),10~14 d為膨大高峰期(圖3、圖4)。二者均在7 d左右在外植體表面出現(xiàn)少量顆粒狀愈傷組織,15~20 d愈傷組織形成與積累達到相對高峰。胚作為外植體形成的愈傷組織多發(fā)生在外植體側(cè)面或遠(yuǎn)培養(yǎng)基端,愈傷多成淡黃色或乳白色;子葉愈傷組織的多發(fā)生在外植體側(cè)面與近培養(yǎng)基端居多,且愈傷多呈淡黃色。

對于胚而言,在f培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳(誘導(dǎo)率93.10%),而同樣條件下子葉外植體脫分化效果處于較低水平(誘導(dǎo)率43.33%);同樣,對于子葉而言愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳的激素組合配比為i培養(yǎng)基(誘導(dǎo)率93.33%),而此條件對胚(誘導(dǎo)率61.54%)并非最佳。由此可見,兩種外植體對不同生長調(diào)節(jié)因子的敏感性存在較大差異,需要針對外植體的特點,選擇適合該外植體愈傷組織誘導(dǎo)的恰當(dāng)?shù)募に胤N類與濃度配比條件。

2.4 激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4.1 2,4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 2,4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表3。Ⅰ~Ⅲ培養(yǎng)基之間在膨大率與誘導(dǎo)率兩個效應(yīng)變量上差異顯著。結(jié)果表明, 2,4-D是影響柑橘子葉外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織的重要因子。當(dāng)2,4-D濃度為2.0 mg/L(處理Ⅱ)時誘導(dǎo)率為86.58%,顯著高于處理Ⅰ(72.33%)(P<0.05),較高濃度2,4-D更有利于愈傷組織的發(fā)生;處理Ⅱ與處理Ⅲ之間差異不顯著,2.0~3.0 mg/L 2,4-D是柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)較為合適的濃度范圍。2,4-D對柑橘愈傷組織的結(jié)構(gòu)與質(zhì)地沒有明顯的影響作用,Ⅰ~Ⅲ培養(yǎng)基之間疏松愈傷組織的誘導(dǎo)率差異不顯著。

2.4.2 KT對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 培養(yǎng)基中2,4-D濃度為2.0 mg/L水平, KT濃度對柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表4。培養(yǎng)基中添加KT可使愈傷組織的誘導(dǎo)率增加13.04%(KT為0.1 mg/L)與 25.75%(KT為0.5 mg/L),培養(yǎng)基中KT激素的添加對柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)具有一定的促進作用。KT與2,4-D配合使用更加有利于外植體的脫分化,膨大率與誘導(dǎo)率效果顯著性高于使用2,4-D(P<0.05);且形成的愈傷組織中疏松愈傷組織占的比例相對較大,愈傷組織的積累量也較多。在柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中KT與2,4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用。

3 小結(jié)與討論

愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生受外植體類型、光照條件、植物基因型等諸多因素的影響,其中植物生長物質(zhì)對植物離體培養(yǎng)中的細(xì)胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調(diào)節(jié)作用[8],尤其是生長素類和細(xì)胞分裂素類的對于誘導(dǎo)原基的形成非常重要[9,10]。本試驗以耐寒柑橘為試材,分析了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2,4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)。結(jié)果表明,MT培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比,更有利于耐寒柑橘愈傷組織的發(fā)生和愈傷組織的積累。MS培養(yǎng)基是普遍使用的植物組培培養(yǎng)基,其對固體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織效果明顯。MT培養(yǎng)基不僅保留了MS培養(yǎng)基中高硝酸鹽、鉀和銨的特點,而且含有更為豐富的煙酸、維生素B6等有機物,能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求,是一種較適合柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

帶外種皮消毒能夠相對更好地保持柑橘種子胚與子葉細(xì)胞相對高活力狀態(tài),因此更有利于其脫分化與愈傷組織形成。柑橘種子胚與子葉在不同激素組合培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)效果差異很大,其適合的激素組合濃度配比不同,這可能與外植體本身所含的外植體的種類、質(zhì)量濃度水平差異和對外源激素的反應(yīng)靈敏性不同有關(guān)[11]。在多數(shù)植物愈傷組織的誘導(dǎo)中,2,4-D是一個很有效的激素[12,13],對柑橘而言,較高質(zhì)量濃度的2,4-D同樣有利于愈傷組織的發(fā)生,但2,4-D只影響柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)率,而對愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì)沒有顯著影響。添加一定濃度的KT可以很大程度上增加了愈傷組織的誘導(dǎo)率,而且可以改變愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì),更有利于疏松愈傷組織的形成與積累,這充分證明了KT與2,4-D在愈傷誘導(dǎo)方面的協(xié)同促進作用。

參考文獻:

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2.3 外植體類型對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別將柑橘子葉和胚外植體接種于a~i培養(yǎng)基中,柑橘種子胚在第5天左右開始膨大,子葉則相對遲緩,外植體膨大時間略晚(2~3 d),10~14 d為膨大高峰期(圖3、圖4)。二者均在7 d左右在外植體表面出現(xiàn)少量顆粒狀愈傷組織,15~20 d愈傷組織形成與積累達到相對高峰。胚作為外植體形成的愈傷組織多發(fā)生在外植體側(cè)面或遠(yuǎn)培養(yǎng)基端,愈傷多成淡黃色或乳白色;子葉愈傷組織的多發(fā)生在外植體側(cè)面與近培養(yǎng)基端居多,且愈傷多呈淡黃色。

對于胚而言,在f培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳(誘導(dǎo)率93.10%),而同樣條件下子葉外植體脫分化效果處于較低水平(誘導(dǎo)率43.33%);同樣,對于子葉而言愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳的激素組合配比為i培養(yǎng)基(誘導(dǎo)率93.33%),而此條件對胚(誘導(dǎo)率61.54%)并非最佳。由此可見,兩種外植體對不同生長調(diào)節(jié)因子的敏感性存在較大差異,需要針對外植體的特點,選擇適合該外植體愈傷組織誘導(dǎo)的恰當(dāng)?shù)募に胤N類與濃度配比條件。

2.4 激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4.1 2,4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 2,4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表3。Ⅰ~Ⅲ培養(yǎng)基之間在膨大率與誘導(dǎo)率兩個效應(yīng)變量上差異顯著。結(jié)果表明, 2,4-D是影響柑橘子葉外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織的重要因子。當(dāng)2,4-D濃度為2.0 mg/L(處理Ⅱ)時誘導(dǎo)率為86.58%,顯著高于處理Ⅰ(72.33%)(P<0.05),較高濃度2,4-D更有利于愈傷組織的發(fā)生;處理Ⅱ與處理Ⅲ之間差異不顯著,2.0~3.0 mg/L 2,4-D是柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)較為合適的濃度范圍。2,4-D對柑橘愈傷組織的結(jié)構(gòu)與質(zhì)地沒有明顯的影響作用,Ⅰ~Ⅲ培養(yǎng)基之間疏松愈傷組織的誘導(dǎo)率差異不顯著。

2.4.2 KT對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 培養(yǎng)基中2,4-D濃度為2.0 mg/L水平, KT濃度對柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表4。培養(yǎng)基中添加KT可使愈傷組織的誘導(dǎo)率增加13.04%(KT為0.1 mg/L)與 25.75%(KT為0.5 mg/L),培養(yǎng)基中KT激素的添加對柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)具有一定的促進作用。KT與2,4-D配合使用更加有利于外植體的脫分化,膨大率與誘導(dǎo)率效果顯著性高于使用2,4-D(P<0.05);且形成的愈傷組織中疏松愈傷組織占的比例相對較大,愈傷組織的積累量也較多。在柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中KT與2,4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用。

3 小結(jié)與討論

愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生受外植體類型、光照條件、植物基因型等諸多因素的影響,其中植物生長物質(zhì)對植物離體培養(yǎng)中的細(xì)胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調(diào)節(jié)作用[8],尤其是生長素類和細(xì)胞分裂素類的對于誘導(dǎo)原基的形成非常重要[9,10]。本試驗以耐寒柑橘為試材,分析了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2,4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)。結(jié)果表明,MT培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比,更有利于耐寒柑橘愈傷組織的發(fā)生和愈傷組織的積累。MS培養(yǎng)基是普遍使用的植物組培培養(yǎng)基,其對固體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織效果明顯。MT培養(yǎng)基不僅保留了MS培養(yǎng)基中高硝酸鹽、鉀和銨的特點,而且含有更為豐富的煙酸、維生素B6等有機物,能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求,是一種較適合柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

帶外種皮消毒能夠相對更好地保持柑橘種子胚與子葉細(xì)胞相對高活力狀態(tài),因此更有利于其脫分化與愈傷組織形成。柑橘種子胚與子葉在不同激素組合培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)效果差異很大,其適合的激素組合濃度配比不同,這可能與外植體本身所含的外植體的種類、質(zhì)量濃度水平差異和對外源激素的反應(yīng)靈敏性不同有關(guān)[11]。在多數(shù)植物愈傷組織的誘導(dǎo)中,2,4-D是一個很有效的激素[12,13],對柑橘而言,較高質(zhì)量濃度的2,4-D同樣有利于愈傷組織的發(fā)生,但2,4-D只影響柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)率,而對愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì)沒有顯著影響。添加一定濃度的KT可以很大程度上增加了愈傷組織的誘導(dǎo)率,而且可以改變愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì),更有利于疏松愈傷組織的形成與積累,這充分證明了KT與2,4-D在愈傷誘導(dǎo)方面的協(xié)同促進作用。

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2.3 外植體類型對耐寒柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的影響

分別將柑橘子葉和胚外植體接種于a~i培養(yǎng)基中,柑橘種子胚在第5天左右開始膨大,子葉則相對遲緩,外植體膨大時間略晚(2~3 d),10~14 d為膨大高峰期(圖3、圖4)。二者均在7 d左右在外植體表面出現(xiàn)少量顆粒狀愈傷組織,15~20 d愈傷組織形成與積累達到相對高峰。胚作為外植體形成的愈傷組織多發(fā)生在外植體側(cè)面或遠(yuǎn)培養(yǎng)基端,愈傷多成淡黃色或乳白色;子葉愈傷組織的多發(fā)生在外植體側(cè)面與近培養(yǎng)基端居多,且愈傷多呈淡黃色。

對于胚而言,在f培養(yǎng)基上脫分化效果相對最佳(誘導(dǎo)率93.10%),而同樣條件下子葉外植體脫分化效果處于較低水平(誘導(dǎo)率43.33%);同樣,對于子葉而言愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳的激素組合配比為i培養(yǎng)基(誘導(dǎo)率93.33%),而此條件對胚(誘導(dǎo)率61.54%)并非最佳。由此可見,兩種外植體對不同生長調(diào)節(jié)因子的敏感性存在較大差異,需要針對外植體的特點,選擇適合該外植體愈傷組織誘導(dǎo)的恰當(dāng)?shù)募に胤N類與濃度配比條件。

2.4 激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4.1 2,4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 2,4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表3。Ⅰ~Ⅲ培養(yǎng)基之間在膨大率與誘導(dǎo)率兩個效應(yīng)變量上差異顯著。結(jié)果表明, 2,4-D是影響柑橘子葉外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織的重要因子。當(dāng)2,4-D濃度為2.0 mg/L(處理Ⅱ)時誘導(dǎo)率為86.58%,顯著高于處理Ⅰ(72.33%)(P<0.05),較高濃度2,4-D更有利于愈傷組織的發(fā)生;處理Ⅱ與處理Ⅲ之間差異不顯著,2.0~3.0 mg/L 2,4-D是柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)較為合適的濃度范圍。2,4-D對柑橘愈傷組織的結(jié)構(gòu)與質(zhì)地沒有明顯的影響作用,Ⅰ~Ⅲ培養(yǎng)基之間疏松愈傷組織的誘導(dǎo)率差異不顯著。

2.4.2 KT對愈傷組織誘導(dǎo)的影響 培養(yǎng)基中2,4-D濃度為2.0 mg/L水平, KT濃度對柑橘子葉愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表4。培養(yǎng)基中添加KT可使愈傷組織的誘導(dǎo)率增加13.04%(KT為0.1 mg/L)與 25.75%(KT為0.5 mg/L),培養(yǎng)基中KT激素的添加對柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)具有一定的促進作用。KT與2,4-D配合使用更加有利于外植體的脫分化,膨大率與誘導(dǎo)率效果顯著性高于使用2,4-D(P<0.05);且形成的愈傷組織中疏松愈傷組織占的比例相對較大,愈傷組織的積累量也較多。在柑橘愈傷組織誘導(dǎo)中KT與2,4-D之間具有良好的正向協(xié)同作用。

3 小結(jié)與討論

愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生受外植體類型、光照條件、植物基因型等諸多因素的影響,其中植物生長物質(zhì)對植物離體培養(yǎng)中的細(xì)胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調(diào)節(jié)作用[8],尤其是生長素類和細(xì)胞分裂素類的對于誘導(dǎo)原基的形成非常重要[9,10]。本試驗以耐寒柑橘為試材,分析了培養(yǎng)基、消毒處理方式、外植體類型以及2,4-D與KT對柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)。結(jié)果表明,MT培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比,更有利于耐寒柑橘愈傷組織的發(fā)生和愈傷組織的積累。MS培養(yǎng)基是普遍使用的植物組培培養(yǎng)基,其對固體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織效果明顯。MT培養(yǎng)基不僅保留了MS培養(yǎng)基中高硝酸鹽、鉀和銨的特點,而且含有更為豐富的煙酸、維生素B6等有機物,能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的需求,是一種較適合柑橘愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

帶外種皮消毒能夠相對更好地保持柑橘種子胚與子葉細(xì)胞相對高活力狀態(tài),因此更有利于其脫分化與愈傷組織形成。柑橘種子胚與子葉在不同激素組合培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)效果差異很大,其適合的激素組合濃度配比不同,這可能與外植體本身所含的外植體的種類、質(zhì)量濃度水平差異和對外源激素的反應(yīng)靈敏性不同有關(guān)[11]。在多數(shù)植物愈傷組織的誘導(dǎo)中,2,4-D是一個很有效的激素[12,13],對柑橘而言,較高質(zhì)量濃度的2,4-D同樣有利于愈傷組織的發(fā)生,但2,4-D只影響柑橘愈傷組織的誘導(dǎo)率,而對愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì)沒有顯著影響。添加一定濃度的KT可以很大程度上增加了愈傷組織的誘導(dǎo)率,而且可以改變愈傷組織的結(jié)構(gòu)與品質(zhì),更有利于疏松愈傷組織的形成與積累,這充分證明了KT與2,4-D在愈傷誘導(dǎo)方面的協(xié)同促進作用。

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