蔣興亮， 劉素蘭， 易婷婷

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充637000)

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)作為動脈粥樣硬化發(fā)病的獨(dú)立危險因素，與血管疾病存在著密切的聯(lián)系，其機(jī)制可能與對血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的直接或間接損傷及基因毒性作用、增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth musole cell，VSMC)的增殖和遷移、改變血小板功能及影響凝血系統(tǒng)、促進(jìn)血管鈣化等幾個方面有關(guān)［1］。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)在體內(nèi)極易被氧化，在氧化的同時，釋放出活性氧離子(reactive oxygen species，ROS)，過量的 ROS引起分子、細(xì)胞和組織的損傷。ROS在心血管病變，尤其是動脈粥樣硬化過程中扮演重要角色［2］。目前國內(nèi)、外對HHcy患者氧化與抗氧化狀態(tài)研究較少，我們擬通過對HHcy患者血漿代表抗氧化狀態(tài)的循環(huán)谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、對氧磷酯酶1(paraoxonase 1，PON1)活性，反映氧化程度的丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)水平及一氧化氮合酶(nitric oxide synthose，NOS)活性的測定，觀察 HHcy患者氧化與抗氧化狀態(tài)，以探討Hcy致動脈粥樣硬化的機(jī)制。

材料和方法

一、研究對象

以空腹血漿Hcy≥15μmo l/L為診斷HHcy的標(biāo)準(zhǔn)，選擇2011年10月至2012年2月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院患者108例，其中男78例，女30例，年齡25～68歲。根據(jù)血漿Hcy升高的程度將HHcy分為輕度(16～30μmol/L)、中度(31～100 μmol/L)和重度(＞100 μmol/L)［3］，其中輕度組50例、中度組40例、重度組18例。排除冠心病、糖尿病、高血壓、甲狀腺功能異常、急性感染、嚴(yán)重營養(yǎng)不良、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病及惡性腫瘤、接受器官移植的患者和近6個月內(nèi)服用葉酸、維生素B6、維生素B12以及影響Hcy水平的藥物(如卡馬西平、苯妥英鈉等)。以同期川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診健康體檢者106名作為正常對照組，其中男66名，女40名，年齡29～65歲，其年齡和性別與HHcy組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，全部經(jīng)體格檢查和血生化、心電圖、腹部B超等檢查無心、肝、腎疾病及糖尿病。

二、方法

1.標(biāo)本收集 所有受檢者禁食12 h，于清晨采集靜脈血液，肝素抗凝，分離血漿，置－20℃保存?zhèn)錂z。

2.血漿PON1活性測定［4］采用速率法測定PON1活性。取試劑1(0.05 mol/L甘氨酸緩沖液，pH 值 10.5，含 1 mmol/L CaCl2、1 mol/L NaCl)150μL，試劑2(試劑1中含1 mol/L對氧磷)50μL，標(biāo)本8μL，測定350～500 s內(nèi)對硝基苯酚產(chǎn)生的速度，波長410/340 nm。對硝基苯酚的摩爾吸光系數(shù)為1.805×104。儀器為日立7170S自動生化分析儀。

3.血漿MDA測定 硫代巴比妥酸法。試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

4.血漿GSH-Px活性測定 5'，5'-二硫代雙2-硝基苯甲酸比色法。試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

5.血漿NO及NOS測定 分別采用硝酸酶還原法及化學(xué)比色法測定血漿NO及NOS。試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

6.血漿Hcy測定采用酶循環(huán)法。試劑盒由四川新成生物科技有限責(zé)任公司提供。

7.血脂測定 分別采用磷酸甘油氧化酶-過氧化酶法、膽固醇酯酶-膽固醇氧化酶法、清除法(一步法)及選擇性遮蔽法(一步法)測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C);采用透射免疫濁度法測定載脂蛋白A(apo A)、載脂蛋白B(apo B)。試劑盒由浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司提供。所有生化項(xiàng)目均在日立7170S生化分析儀上完成。

8.血漿SOD活性測定 黃嘌呤氧化酶法。試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

9.血漿葉酸測定 離子捕獲免疫分析法。儀器和試劑均由美國雅培公司提供。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、HHcy組和對照組各項(xiàng)指標(biāo)比較

2組的年齡和性別構(gòu)成比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。HHcy組與對照組血脂、體重指數(shù)、血壓差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

二、HHcy組與對照組血漿 PON1、GSH-Px、SOD、NOS活性及MDA、NO、葉酸水平比較

HHcy患者血漿 PON1、SOD、GSH-Px、NOS 活性及NO水平明顯低于正常對照組(P＜0.01)，血漿MDA水平則明顯高于正常對照組(P＜0.01)，見表2。

表1 HHcy組和正常對照組一般資料的比較(±s)

表1 HHcy組和正常對照組一般資料的比較(±s)

注:與正常對照組比較＊＊P＜0.01，*P＜0.05

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表2 HHcy組和正常對照組血漿PON1、SOD、GSH-Px、NOS活性及MDA、NO水平比較(±s)

表2 HHcy組和正常對照組血漿PON1、SOD、GSH-Px、NOS活性及MDA、NO水平比較(±s)

注:與正常對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

?

三、HHcy患者血漿 Hcy與PON1、GSH-Px、SOD、NOS、MDA、NOS 的相關(guān)性分析

HHcy患者血漿 Hcy與PON1、GSH-Px、SOD、NOS、NO呈明顯負(fù)相關(guān)，與MDA呈明顯正相關(guān)，見表3。

表3 HHcy患者血漿Hcy與PON1、GSH-Px、SOD、NOS、MDA、NO 的相關(guān)性分析

討 論

心腦血管疾病患病率與病死率迄今仍居高不下，已成為威脅人類健康的主要疾病之一。而動脈粥樣硬化(AS)是該類疾病重要的病理基礎(chǔ)。Hcy是體內(nèi)蛋氨酸代謝途徑中形成的一種含硫氨基酸，屬于蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物。近年來大量研究證實(shí)，HHcy成為繼高血脂、高血壓、糖尿病、吸煙等因素之后AS和血栓性疾病的一個新的、重要的、獨(dú)立的危險因素。據(jù)估計有5%～7%的普通人血中Hcy有輕至中度的增高，而40%以上確診為冠狀動脈疾病、腦血管疾病、外周動脈阻塞性疾病、周圍血管性疾病或反復(fù)性靜脈血栓癥的患者都伴有HHcy［5］。因此，Hcy的致病機(jī)制研究成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，HHcy患者血漿MDA水平明顯高于正常對照組(P＜0.01)，PON1、GSH-Px、SOD、NO、NOS水平明顯降低(P＜0.01)，且血漿Hcy與MDA呈明顯正相關(guān)(P＜0.01)，與PON1、GSH-Px、MDA、SOD、NO、NOS呈明顯負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。GSH-Px和SOD均為人體內(nèi)重要的抗氧化酶，在水解ROS的過程中逐步被消耗，使其直接參與血中脂質(zhì)過氧化物的水解的能力減弱，不能有效清除過氧化物，特別是脂質(zhì)過氧化物，使其在血中大量蓄積。本研究結(jié)果顯示HHcy患者體內(nèi)GSH-Px、SOD活性均明顯降低，提示其抗氧化能力降低。而MDA為脂質(zhì)過氧化的較穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物之一，其水平升高提示脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示HHcy患者M(jìn)DA水平明顯增高，說明其體內(nèi)存在脂質(zhì)過氧化的傾向。

PON1是近年來頗受關(guān)注的一種抗氧化酶，與還原型谷胱甘肽(GSH)有協(xié)同抗氧化作用［6］。PON1的主要作用一是通過過氧化物酶樣作用，降解高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)中的氧化脂肪酸和氧化膽固醇，減少脂質(zhì)的過氧化以抑制LDL和HDL的氧化，保護(hù)HDL的抗氧化功能和逆行轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的功能［7］，抵抗低密度脂蛋白的氧化而減少氧化低密度脂蛋白的生成;二是降解Hcy的代謝產(chǎn)物硫內(nèi)酯，以減少其致動脈粥樣硬化作用［8］。

因此，HHcy患者由于種種原因使ROS產(chǎn)生過多，抗氧化酶如GSH-Px、SOD和PON1及其他抗氧化劑在與ROS的作用中消耗或抗氧化酶產(chǎn)生減少，導(dǎo)致抗氧化酶及其他抗氧化劑不同程度下降，不能清除體內(nèi)過多的ROS，氧化與抗氧化失衡，大量的ROS在體內(nèi)蓄積，可能通過多種機(jī)制參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

導(dǎo)致HHcy患者氧化應(yīng)激增強(qiáng)的因素還不完全清楚，可能與下列因素有關(guān):第一，Hcy含自由巰基，在金屬離子(Fe3+和Cu2+)的存在下，可以自身氧化成同型胱氨酸、Hcy混合性二硫化物和Hcy硫內(nèi)酯，同時產(chǎn)生H2O2、羥自由基(OH·)和超氧陰離以加劇LDL的氧化反應(yīng)，形成ox-LDL，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生［9］。另外，Hcy抑制前列環(huán)素的合成，在黃嘌呤氧化酶催化的氧化反應(yīng)及花生四烯酸代謝途徑中產(chǎn)生的大量自由基、過氧化物及其他有高度活性的物質(zhì)都參與了Hcy對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用。第二，Hcy抑制抗氧化酶活性。H2O2生成后可自由地穿透細(xì)胞膜，迅速被GSH-Px還原生成H2O。研究顯示，Hcy可以降低內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài)的GSH-Px的mRNA水平，并抑制酶的活性，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化機(jī)制受損，并加強(qiáng)了超氧自由基介導(dǎo)的NO滅活作用［10］。SOD是超氧離子歧化的必需催化酶，具有保護(hù)細(xì)胞不受氧自由基損害的作用。Hcy可抑制其表達(dá)和分泌，導(dǎo)致其對細(xì)胞的保護(hù)作用減弱。第三，Hcy對NO的影響。Hcy氧化過程中產(chǎn)生的H2O2、，可使NO氧化生成過氧亞硝基(ONOO－)，使NO失去生物活性。當(dāng)HHcy時，Hcy長期作用于內(nèi)皮細(xì)胞使得NOS受損，NOS基因表達(dá)減少，NO合成減少。由于NO相對缺乏，S-亞硝基-同型半胱氨酸(S-NO-Hcy)生成減少，導(dǎo)致未被NO結(jié)合的游離Hcy損傷內(nèi)皮細(xì)胞，而受損的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO更少，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死［11］。此外，Hcy通過增加NOS抑制劑非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)的生成，而降低內(nèi)皮細(xì)胞釋放 NO［12］。

本研究結(jié)果只針對單純HHcy患者氧化與抗氧化指標(biāo)的變化，而以前多集中于HHcy合并糖尿病、腦梗死等患者中氧化與抗氧化指標(biāo)的變化的研究，其結(jié)果基本一致，說明HHcy患者無論有無臨床表現(xiàn)，其氧化與抗氧化已失衡，尤其是單純HHcy患者其氧化與抗氧化指標(biāo)已發(fā)生明顯變化，應(yīng)引起臨床高度重視。

綜上所述，HHcy患者ROS產(chǎn)生增加，機(jī)體的抗氧化酶在清除ROS時其活性降低，導(dǎo)致抗氧化能力下降，使體內(nèi)氧化與抗氧化處于不平衡狀態(tài)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，通過氧化應(yīng)激機(jī)制參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。因此，有必要關(guān)注HHcy患者體內(nèi)氧化與抗氧化狀態(tài)。

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